The chemically synthesized codon-optimized SLC10A1 (UniProt accession number: Q14973) gene was inserted into a modified pFastBacHT-B vector with a haemagglutinin (HA) signal sequence at the N terminus and a HRV3C protease site followed by GFP and a ten-residue His tag at the C terminus.使用重叠延伸PCR产生突变。对于NTCP表达，使用BAC-BAC杆状病毒表达系统产生高尊敬病毒。SF9细胞以每毫升的2至3×106细胞的密度感染，并以高尊敬的病毒量为5倍多种感染（MOI）感染。感染后24小时加入二十个微摩尔TCA，以促进NTCP的表达。在27°C下进一步培养感染的细胞36-48小时，然后收集。用PSB洗涤细胞，以去除培养基的痕迹，并使用低渗性缓冲液（10 mM HEPES（pH 7.5），10 mM MGCL2和20 mM KCl）重悬于，并存储在-80°C下直至进一步使用。为了纯化膜级分，在蛋白酶抑制剂鸡尾酒（ROCHE）的情况下，将洗涤的细胞在低渗性缓冲液中破坏，然后在高渗透缓冲液（10 mM HEPES（pH 7.5），1 M NaCl，10 mM MGCL2和20 mM KCl）中破坏。将纯化的膜溶解在含有10 mM HEPE（pH 7.5），150 mM NaCl，10 mM MGCL2、20 mM KCl，1％（w/v）DDM（Anatrace），0.2％（w/v）CHS（Anatrace）的2.5 H的缓冲液中。通过在264,902g，4°C下进行超速离心40分钟，将不溶性材料去除，并将上清液与darpin偶联的CNBR激活的Sepharose 4快速流量珠一起孵育，以在4°C下过夜。将树脂用10列量的洗涤缓冲液I洗涤，其中含有50 mM HEPE（pH 7.5），800 mm NaCl，5％（v/v）甘油，0.05％（w/v）DDM，0.01％（w/v）CH，然后含有10次洗涤Buffer II的10列5％（pH）（pH）（pH 7.5）（pH）（15％）（15％）（pH）（pH）。甘油，0.05％（w/v）DDM，0.01％（w/v）CHS，然后是另外10列的洗涤缓冲液I。用于洗脱树脂结合的NTCP， 将HRV3C蛋白酶和PNGase F施加到树脂上，并在4°C轻轻孵育16小时。使用具有100 kDa MW截止的Amicon Ultra离心机浓缩纯化的NTCP，然后应用于SuperDex 200 10/300列（GE Healthcare），并用含有50 mM HEPES（pH 7.5），500 mm Nacl，0.05％的0.05％（0.05％（W/v）的缓冲液进行预校准，并01DM和0.01DM和0.01DM，并且大小排斥色谱（SEC）后，合并了NTCP的单体部分。

　　将Bodipy FL 1-囊结（BFC）（Invitrogen）溶解在二甲基磺代（DMSO）中，浓度为10 mm。用去离子水稀释10 mM BFC库存，以20μm的浓度生产最终的BFC库存。在PCR管中混合了9微透明的蛋白质样品，浓度为2 mg ml -1和1μl20μMBFC的库存。使用CFX96触摸深井实时PCR检测系统（Bio-RAD）进行所有差异扫描荧光测量。FAM通道中的CFX Maestro Software 2.0（Bio-Rad）进行了融化曲线实验。将样品冷却至4°C，并在该温度保持1分钟，然后将温度提高到每分钟100°C至100°C。然后将熔融曲线结果拟合到Boltzmann Sigmoid，以确定蛋白质样品的熔化温度。

　　所有动物实验都符合日本实验动物的护理和使用指南的指南，并得到了京都大学动物实验委员会的批准。Rattus Norvegicus NTCP（Uniprot登录号：P26435）有362个残基。该序列的残基1至316使用Q261a突变，使用SF9-巴克洛病毒系统表达并纯化。如先前所述，基本上提出了针对大鼠NTCP（Q261a）的小鼠单克隆抗体（Q261a）。简而言之，通过将高密度的纯化大鼠NTCP（Q261a）重新构建为磷脂囊泡，制备蛋白质脂质体抗原，该抗原由磷脂囊泡组成，该磷脂囊泡由鸡蛋蛋黄磷脂酰胆碱（Avanti Polar Lipids）和辅助性Lipid lipid lipid lipid a（sigma-aldrich）组成10：1混合物。

　　在12小时的光周期下，雌性为6周大的MRL/LPR小鼠在22至26°C和40％至60％的湿度之间维持在40％至60％的湿度之间，并使用3次注射蛋白脂质体抗原以2周的间隔进行免疫。使用常规融合方案产生产生抗体的杂交瘤细胞系。

　　通过将大鼠NTCP（Q261a）与蛋中的混合物和1,2-二硫硫莫酰基-SN-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（CAP Biotinyl）重构大鼠NTCP（Q261a）来制备生物素化的蛋白质脂质体（16：0 biotinyl cap-pe; avanti），并使用AS AS INSTAIC STECS，并使用了结合目标。将靶标固定在链霉亲和素涂层的微板上（NUNC）上。通过对固定的生物素化蛋白脂质体（Liposomeme ELISA）的酶 - 连接的免疫吸附测定法选择了大鼠NTCP（Q261a）识别构象表位的杂交瘤克隆，从而识别抗体选择了抗体选择，从而使天然综合型（Q2）NTTC（Q2）。对与SDSNEDATURED大鼠NTCP（Q261A）抗体结合减少的额外筛选用于针对线性表位识别抗体的阴性选择。使用荧光检测SEC检查大鼠NTCP（Q261a）和每个抗体克隆之间的稳定复合物形成。分离了总共13种单克隆抗体，该抗体特异性结合并稳定大鼠NTCP中的构象表位（Q261a）。通过SEC进一步评估了对人NTCP的抗体的交叉反应性，并最终选择了用于冷冻EM单粒子分析的抗体克隆数YN69083的FAB。使用从杂交瘤细胞中分离的总RNA通过标准5'-RACE确定Fab YN69083的序列。

　　将纯化的NTCP与Fab YN69083混合，以2：3摩尔比。在4°C下孵育1小时后，将Lauryl麦芽糖新乙醇（LMNG）添加到NTCP -FAB络合物中，以终浓度为0.1％。在4°C下孵育1小时后，为了去除残留的DDM和CH，将重构的NTCP -FAB复合物加载到超级dex 200 10/300柱上，以50 mm的HEPE（pH 7.5），150 mm NaCl，NaCl，0.0055％LMNG平衡。使用Vivaspin浓缩剂（100 kDa截止器； GE Healthcare），将含有NTCP-FAB复合物的峰值分数合并为6 mg ml-1。使用Vitrobot Mark IV仪器（Thermo Fisher Scientific），将四个微量的蛋白质应用于发光脱释量的Quantifoil R0.6/1 300网格孔网格网格，并在100％湿度和4°C下以0 s的含量为0 s。在液体乙烷中陷入液化后，将网格存储在液氮中，并进行冷冻EM数据收集和分析。

　　在Titan Krios G4（Thermo Fischer Scientific）上进行的冷冻EM成像以300 kV的作用，配备了GATAN量子LS Energy滤波器（SLIT宽度15 eV）和Gatan K3 Direct Electron探测器，名义上的电子探测器的标称放大倍数为105,000×，以105,000倍的速度为单位，在电子置换模式下，对应于0.833的PIXEL pecep Pixel。在第一个数据集中，每个堆栈电影的记录为每秒15.5电子，每秒为2.3 s，导致50.5 e -Å -2的累积暴露。在第二个数据集中，每个堆栈电影记录为每秒9.05 E-每秒9.05 E-持续5 s，导致累积的暴露量为64 e -Å -2。这些数据是通过使用EPU软件自动获取的，具有-0.8至-2.0μm的EPU软件。在第一个数据集中获得了约5,846个电影堆栈，第二个数据集获得了15,121个。所有图像处理均使用Relion-3.1.128进行。使用MotionCor229对剂量分级的图像堆栈进行梁诱导的运动校正，并使用CTFFIND430估算对比度传递函数参数。在第一个数据集中，使用显微照片的Cryolo31挑选了总共3,371,075个颗粒，并以1.65Å的像素大小提取。这些粒子进行了几轮2D和3D分类。然后根据像素大小为0.83Å，重新提取所选的201,603个颗粒，并经过3D细化，贝叶斯抛光32，然后根据傅立叶壳相关（FSC）= 0.143 CriteriTion33。在第二个数据集中，使用显微照片的冰冻31挑选颗粒，并以3.28Å的数据像素大小提取2,643,988个颗粒。将这些颗粒进行几轮2D和3D分类。然后以0.83Å的像素大小重新提取所选的486,859个颗粒，并进行3D细化，贝叶斯抛光， 根据FSC = 0.143标准，随后的地图后处理将其全局分辨率提高到3.3Å。

　　NTCP – FAB YN69083复合物的初始模型是使用COOT34构建的，以适合Y. Frederiksenii Asbt（E254A）5（PDB 4N7X）的Y. Y. frederiksenii Asbt（PDB 4N7X），抗体片段晶圆厂结构（PDB 5MYX）35 35纳入cryo-em映射。高分辨率的冷冻EM图允许NTCP和Fab YN69083（扩展数据图4）的侧链分配，并显示两者之间接触区域的清晰密度。使用phenix.Real_ -Space精炼进一步手动调整整个结构和精制。NTCP – FAB YN69083复合结构的数据收集，处理，改进和验证统计数据在扩展数据表1中列出。

　　将HEPG2-NTCP-C4和HEPG2细胞与DMEM/F-12 +谷氨酸辅助保持10 mM HEPES，100μgml-1链霉素，100 U ML-1 Penicillin，10％FBS，5 µg ML-1胰岛素和400 µg ML-1 g41 g41 g41810。将HuH7细胞培养在含有10％FBS，100μgml-1链霉素，100 U ML-1 Penicillin，100μM非必需氨基酸，1 mM丙酮酸钠和10 mM Hepes37的Dulbecco改良的Eagle培养基中。

　　如先前所述，建立了HepG2细胞中稳定表达人NTCP基因的HEPG2-NTCP-C4细胞。该细胞系用于HBV感染测定，PRES1结合测定和图1A中的细胞活力测定。根据制造商的方案13，通过将相应的表达质粒3000转染通过转染相应的表达质粒3000产生了瞬时表达野生型或突变体NTCP的HEPG2和HUH7细胞。检查了这些细胞以评估图2C中的HBV感染，图2D和NTCP转运蛋白分析中的PRES1结合测定法，图3C，d。

　　如先前所述，通过PRES1结合测定评估HBV PRES1介导的对细胞的附着。13。将细胞用40 nm c-末端的tamra偶联和N末端肉豆蔻酰化的PER1肽培养，在37°C的PRES1区域（PER1探针）跨度为2-48，在37°C下持续30分钟，然后将PRES1探头培养。然后用4％多聚甲醛将细胞固定，用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，以通过荧光显微镜观察Prep1探针（红色）和细胞核（蓝色）的荧光。在50 mM HEPES pH 7.5、500 mM NaCl，0.03％DDM中，外源野生型或突变体RHNTCP添加了0.006％CHS，以测试PRES1结合的测试阻断。

　　如前所述，制备了源自HEP38.7-TET细胞（基因型D）的培养上清液的HBV接种物，用于HBV感染测定38。在4％聚乙烯乙二醇8000（PEG8000）存在16小时的情况下，在每个细胞的4,000基因组等效物（GEQ）以4,000基因组等效物（GEQ）接种HEPG2-NTCP。清洗自由HBV后，将细胞培养12天，并收集以评估HBV感染。ELISA和免疫荧光分别检测到培养上清液中的HB和HBV核心蛋白（HBC），前面描述了前39及以下。Myrcludex B用作阳性对照，据报道抑制HBV感染39。在PRES1结合测定中，添加了外源性RHNTCP（使用）。

　　基本上按照所述测量NTCP的转运蛋白活性40。The cells were incubated with [3H]-TCA in either sodium-containing buffer (5 mM KCl, 1.1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1.8 mM CaCl2, 10 mM -glucose, 10 mM HEPES, 136 mM NaCl) or sodium-free buffer (5 mM KCl, 1.1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4,1.8 mM CaCl2，10 mm-葡萄糖，10 mm HEPES，136 mm NMDG）在37°C下3分钟，以允许[3H] -TCA吸收细胞41。洗涤以去除自由[3H] -TCA后，将细胞裂解以通过液体闪烁计数器测量细胞内放射性。图3C使用20μM[3H] -TCA作为底物显示了天然和突变蛋白的NTCP转运蛋白活性。图3D显示了NTCP的活性，存在各种浓度的TCA（0.5、1、3、6、10、20和30μM），以及NTCP（野生型），NTCP（L27/31W），NTCP（L31/35W）和NTCP（L27/31/31/35W）的NTCP（L27/31W），NTCP（L27/31W）的KM值。

　　通过如前所述的MTT分析确定细胞活力38。

　　NTCP变体是由寡核苷酸指导的诱变产生的。使用XHOI和XBAI地点将突变的DNA插入了CSII-EF-MCS质粒（来自H. Miyoshi的礼物）43,44。根据制造商的方案45，使用Lipofectamine 3000将这些质粒转染到细胞中。

　　基本上如前所述进行了免疫荧光分析45。通过用4％多聚甲醛处理并用0.3％Triton X-100处理HBV感染的细胞。阻止细胞后，将它们用针对HBC的一抗作为1：200稀释（Thermo Fisher Scientific）处理，然后与Alexa Fluor 594偶联的二级抗体孵育为1：500稀释和DAPI。使用荧光显微镜观察HBV阳性细胞。

　　基本上如前所述进行了免疫印迹分析38。用SDS样品缓冲液（100 mM Tris-HCL（pH 6.8），4％SDS，20％甘油，10％2-甲醇）裂解细胞。The cell lysate was examined using SDS–PAGE and reacted with 1:3,000-diluted anti-HA (Abcam; for NTCP–HA detection) or 1:10,000-diluted anti-actin (Sigma-Aldrich) antibodies as primary antibodies, followed by reaction with horseradish peroxidase (HRP)–conjugated secondary antibodies as 1:3,000 dilution.在通过SDS – PAGE16分析之前，用250 U PNGASE F处理了含有NTCP-HA的样品，以从糖蛋白中去除N-连接的寡糖。未编写的SDS -PAGE图像如图1所示。

　　使用UCSF Chimera（V1.15）46，UCSF Chimerax v1.2.1）或Pymol（v2.3）48生成所有数字。使用CastP 3.049计算结合口袋体积。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。