对于所有人类组织和细胞研究，都获得了知情同意，并根据斯坦福大学机构审查委员会批准的方案使用组织。

　　所有体内实验均根据斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行，并根据机构指南进行。IACUC实施了美国农业部（USDA），公共卫生服务（PHS）政策，加利福尼亚州法规和斯坦福大学政策和准则的法规，以确保有效和道德的动物研究计划。根据标准指南饲养动物，并在12小时的光线为12小时的黑暗周期，温度为21°C和60％的湿度中免费获得食物和水。对于脑肿瘤异种移植实验，IACUC并未对最大肿瘤体积设定限制，而是对发病率的迹象。在没有实验的情况下，这些限制超出了这些限制，因为它们表现出神经系统发病率或减轻了15％或更多的体重，就会对它们进行安乐死。

　　对于所有异种移植研究，都使用了NSG小鼠（NOD-SCID-SCID-SCID-SCID-SCID-SCID-SCID-IL2Rγ链缺陷；杰克逊实验室）。雄性和雌性小鼠平均使用。培养的SU-DIPG-VI – GFP，SU-DIPG-XIII-FL – GFP，SU-DIPG-50 – GFP，SU-PCGBM2 – GFP或SU-DIPG-XIII-PONS患者患者胶质瘤细胞的单细胞悬浮液在Xenograpter之前，准备在Xenograpter之前，准备了3,47。在产后第28-30天（P28–30）的动物用1-4％的异氟烷​​麻醉，并放置在立体定位设备中。颅骨在无菌条件下通过中线切口暴露。在3 µL无菌PBS中，大约300,000个细胞通过26口径的Burr孔立体定位，使用数字泵以0.4 µl min-1和26口径的汉密尔顿注射器的输注速度植入。对于所有电生理学和光遗传学实验，将细胞植入海马的CA1区域（1.5 mm横向至中线，theboregma后方-1.8 mm，至颅面深-1.4 mm）。Su-DiPG-XIII-FL – GFP和SU-PCGBM2 – GFP用于劳拉西am处理，将异种移植物被异种移植到前皮层中（0.5 mm横向至中线，前线为1.0 mm，前BREGMA前1.0 mm，深1.75 mm深到颅面）。对于丘脑异种，坐标为1.0 mm至中线，lambda后部为-0.8 mm，到颅面深-5.0 mm。输注完成后，允许注射器针保持在适当的位置2分钟，然后以0.875 mm min -1的速度手动撤回，以最大程度地减少注入的细胞悬浮液的回流。使用短串联重复（STR）指纹识别使用患者衍生的神经胶质瘤细胞，以验证身份和缺乏污染。

　　对于体内监测肿瘤生长，使用体内生物发光成像系统（Xenogen）进行生物发光成像。用萤火虫荧光素酶表达H3K27M突变的DMG细胞（SU-DIPG-VI细胞异种移植到PONS）原位异种移植小鼠30。为了成像肿瘤负担，将小鼠放在同氟烷麻醉下，并注入荧光素底物并成像。在基线时对动物成像，并根据对实验条件的研究者的肿瘤大小随机分组，因此实验组含有等效范围的肿瘤大小。然后将所有总通量值归一化为基线值，以确定肿瘤生长的折叠变化。

　　为了对肿瘤增殖的组织学分析，将NSG小鼠与Su-DiPG-VI-GFP，Su-DiPG-XIII-FL – GFP，SU-DIPG-50 – GFP或SU-PCGBM2-GFP细胞以及研究人员随机分配给实验性条件。四到六周后移植后四周，通过腹膜内注射4周（每周5天），用劳拉西m（8 mg-kg-1或2 mg kg-1; hospira）进行全身给药治疗小鼠。用相同体积的相关车辆处理对照。

　　为了分析肿瘤生长，如上所述，对带有SU-DIPG-VI-VI-GFP-LCIFERASE细胞的小鼠进行了生物发光成像，在治疗前和使用Lorazepam治疗后的14天后，被异种移植到PON中。评估了肿瘤负担，因为折叠的发光变化与基线的变化变化。

　　在Lorazepam治疗生存研究中，将Su-Dipg-XIII-PON细胞定为上述PON，并给予Lorazepam（低剂量的2 mg kg-1腹膜内，高剂量的高剂量为8 mg kg kg kg kg kg kg-kg kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg −1 interaporitoneane或车辆控制或车辆控制）在Xenagrafting和Xenagrafting 5天后进行了3天的锻炼和施用。使用的发病率标准是将重量减轻15％的初始体重或严重的神经系统运动缺陷，这与脑干功能障碍一致（即偏瘫或腹膜中脑功能障碍看到的偏瘫或不可或缺的刻板盘旋行为）。使用对数秩检验进行了Kaplan-Meier生存分析，以确定统计显着性。值得注意的是，小鼠耐受高剂量和低剂量的劳拉西m方案，而不会过度调节。随着较高剂量（8 mg kg -1），小鼠最初表现出降低的活性，但似乎在几天之内被适应剂量，然后在其笼子中通常表现出来。当小鼠死亡（在劳拉西m给药28天后发生的小鼠死亡时，它们都会表现出肿瘤负担增加的症状（运动和平衡症状通常是脑干肿瘤疾病进展）。

　　如先前所述，高级神经胶质瘤培养物Su-DiPG-VI，Su-Dipg-XIII-FL，Su-Dipg-50，Su-Dipg-50，Su-PCGBM2和Su-Dipg-XIII-PONS如先前所述生成。简而言之，根据机构审查董事会批准的方案，在活检时或从死亡后早期捐赠时，从高级神经胶质瘤（WHO III或IV级）肿瘤获得组织。组织在机械和酶上分离，并在定义的，无血清的培养基中指定的“肿瘤茎培养基”，由神经脂肪（-a）（Invitrogen）（Invitrogen），B27（-a）（Invitrogen）（Invitrogen）（Invitrogen）（人类BFGF（20 ng ml-1; Shenandoah），人类Egf（20 ng Ml-1）PDGF-AA（10 ng ML-1）和PDGF-BB（10 ng ml-1; Shenandoah）和肝素（2μgml-1;干细胞技术）。对于所有患者衍生的培养物，定期进行支原体测试，并每3个月进行一次STR DNA指纹识别以验证真实性。先前已经报道了患者衍生的培养物和异种移植模型的STR指纹和临床特征48。

　　我们合并了来自十个成人IDH突变神经胶质瘤样品，三个成人WT IDH神经胶质瘤样品，6个儿科H3K27M突变DMG样品以及患者衍生的SU-DIPG-VI和SU-DIPG-XIII-FL Cells的单细胞转录组的公开单细胞数据集，六个儿科H3K27M-突变的DMG样品以及患者衍生的SU-DIPG-VI和SU-DIPG-XIIII-FL Cells15,32。对于这些数据集的所有分析，使用R Studio 1.4.1106-5。细胞过滤的进行类似于原始研究，从而保留了5,096个IDH突变神经胶质瘤恶性细胞，599个成年WT IDH Glioma恶性细胞和2,259个儿科H3K27M+ DMG恶性细胞。

　　对于大多数分析，使用公式将矩阵中的每百万（TPM）条目进行标准化。该值被除以10，因为假定实际复杂性约为100,000而不是100万，如TPM度量所示。归一化后，通过减去每个细胞中每个基因的平均表达来集中数据。

　　在降低维度之前，我们保留了研究中所有细胞中平均表达最高表达的7,000个基因。然后，我们使用前100个主要组件计算了UMAP X和Y值（扩展数据图3）。

　　GABAARα基因包括：Gabra1，Gabra2，Gabra3，Gabra4，Gabra4，Gabra5和Gabra6。GABAARβ基因包括：GABRB1，GABRB2和GABRB3。GABAARγ基因包括：GABRG1，GABRG2和GABRG3。

　　Total GABAAR genes included: GABRA1, GABRA2, GABRA3, GABRA4, GABRA5, GABRA6, GABRB1, GABRB2, GABRB3, GABRG1, GABRG2, GABRG3, GABRD, GABRE, GABRP, GABRQ, GABRR1, GABRR2 and GABRR3.

　　与GABA能突触相关的总基因包括：Gabra1，Gabra2，Gabra3，Gabra3，Gabra4，Gabra5，Gabra5，Gabra6，Gabrb1，Gabrb1，Gabrb2，Gabrb3，Gabrb1，Gabrg1，Gabrg2GPHN，ARHGEF9，NLGN2，SLC12A2和SLC12A5。

　　对于每个样品，我们进行了第一个细胞级归一化，然后将基因表达围绕0左右进行，以允许主成分分析（PCA）计算。降低PCA后，我们使用共享最近的邻居聚类聚类。为了检查每个群集中每个单元格的各种Gabaar特征，我们使用了Seurat软件包的函数AddModulesCore，该功能计算了通过100个随机选择的对照基因集的100个随机表达式减去基因集的平均表达水平，其中从匹配的25个表达bins对应的表达式表达式中选择了对照基因的表达式表达式表达式表达式表达式，该基因集合。为了计算P值，我们使用Seurat软件包的骨料表达来对每个样品中的细胞进行伪核，从而生成每个样品的平均基因表达水平。P值是通过stat_compare_means通过GGPUBR软件包使用Wilcoxon Rank-sum测试计算的。

　　在H3K27M+ DMG DataSet15中，我们为每个单元格计算了一个“茎分数”。通过从其OPC样分数中减去细胞的AC（类似星形胶质细胞样）得分来确定该分数。我们还计算了每个单元格的“分化分数”，该分别定义为OC和AC分数的最大分数。如果AC分数较高，则将其乘以-1。在AC和OC分数为负的情况下，分配了0的值，并增加了一些抖动。在所有样品中进行核心，并根据图1c中突出显示的基因对细胞进行评分。

　　插入n末端的tagGFP2的密码子优化的GABRG2序列被定制为GBLOCK（IDT DNA）。随后，将其克隆到EF1A启动子下的慢病毒载体中。将所得的质粒转化为TOP10竞选细胞（Thermo Fisher），并进行序列验证。确认正确序列后，将质粒最大化（Qiagen），得出的浓度范围为1至2μgμl -1。克隆后，将质粒与辅助质粒（Pδ8,9和VSV-G）包装在一起，以从粘附HEK293T细胞（Thermo Fisher）中产生复制缺陷的慢病毒。100万个靶标SU-DIPG-VI和SU-DIPG-XIII-FL细胞被Lenti-X（Takara）浓缩病毒上清液感染，并允许恢复至少2周。

　　异种法中八周，用卡诺夫斯基的固定剂通过心心灌注对小鼠安乐死：2％戊二醛（EMS 16000）和4％多聚甲醛（EMS 15700）在0.1 M钠cacodylate中（EMS 12300），pH 7.4。在海马的CA1区域内的异种移植肿瘤质量中进行透射电子显微镜。将样品在室温下在1％四氧化os（EMS 19100）中固定1小时，用超过滤水洗涤3次，然后在室温下染色2小时。然后将样品在4°C下每个分级乙醇（50％，75％和95％）中脱水15分钟。然后，将样品平衡至室温，并在100％乙醇中冲洗两次，然后用乙腈持续15分钟。将样品用嵌入-812树脂（EMS 14120）与乙腈混合2 h混合2小时，然后将嵌入-812与乙腈混合2 h，然后在嵌入812中混合2小时。然后将样品放入带有新鲜树脂的Taab胶囊中，并在65°C下过夜。在40 nm至60 nm之间的切片在超速S（Leica）上进行，并安装在100英寸NI网格（EMS FCF100-NI）上。对于免疫组织化学，用10％周期性酸进行微蚀刻，并在室温下在室温下用10％metaperiodate用10％metaperapoiodate洗脱osmium。将网格用水冲洗三遍，然后用0.5 m的甘氨酸淬灭，然后在室温下在阻塞溶液（0.5％BSA和0.5％的Ovalbumin）中孵育20分钟。将初级兔抗GFP（1：300; MBL国际）稀释在相同的封闭溶液中，并在4°C下孵育过夜。第二天，将网格冲洗在PBS中3次，并在辅助抗体（1:10 10 nm偶联的IgG Ted Pella15732）中孵育1小时，并在室温下用PBST冲洗，然后用水冲洗。对于每个染色组， 同时进行仅次级染色以控制任何非特异性结合。在3.5％乙酸铀酰中的50％丙酮中，将网格染色为30 s，然后在0.2％的柠檬酸铅中染色90 s。使用JEOL JEM-1400传输电子显微镜（TEM）在120 kV中成像，并使用Gatan Orius数码相机收集图像。

　　使用TEM成像对Su-DiPG-VI和Su-Dipg-XIII-FL的海马异种移植物进行了tem成像。总共评估了来自4只小鼠的Su-DiPG-VI异种移植物的78张图像，并评估了来自3只小鼠的SU-DIPG-XIII-FL的137张图像。电子显微镜图像以×60,000，×80,000或×12,000的形式拍摄。GABA能神经元到神经瘤突触被定义为具有明确鉴定的与突触后膜相邻的三个或更多颗粒的免疫粒子标记，此外还有突触小囊泡簇和视觉上明显的突触突触left。

　　使用神经组织解离试剂盒（Miltenyi）和ACK裂解性缓冲液（Gibco）从P0 Sprague-Dawley大鼠幼崽的皮质中分离出神经元，然后由神经元隔离套件，小鼠（MILTENYI），根据制造商的指导。隔离后，将80,000个神经元铺在37°C下用聚赖氨酸（Sigma）（Sigma）预处理1小时的圆形玻璃盖板（电子显微镜服务），然后在37°C下用5 µg ML-1-1小鼠层粘胶（Thermo Fisher）在37°C下进行2 h。神经元在补充了B-27（Invitrogen），1倍谷氨酸（Invitrogen），Penicillin-Stroptomencin（Invitrogen）（Invitrogen），55 µM 2- ercapto乙醇（Gibco），GDNF（GDNF），GDNF（GDNF（GDNF）（5 ng Ml-1; sheng Ml-1; sheng Mlando）的脑元素（干胶技术）中培养。（10 ng ml -1; Shenandoah）和TRO19622（5 µm； Tocris）。一半的培养基在1和3天的体外补充。在5天的体外，早上更换了一半的培养基。下午，将表达TAGGFP2 -GABRG2的60,000个神经胶质瘤细胞铺在一半条件培养基中的神经元上。将神经胶质瘤细胞用神经元培养3天，然后在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟，并进行染色以进行免疫荧光分析，如下所述。使用STR指纹识别常规身份验证使用的患者神经胶质瘤细胞以验证身份和缺乏污染。

　　根据斯坦福大学IACUC批准的方案，制备了含有海马区域的冠状切片（300 µm厚）。快速斩首后，将大脑从头骨上移除，并浸入冰冷的切片人工脑脊液（ACSF）中，含有：125 mm NaCl，2.5 mm KCl，25 mm葡萄糖，25 mm Nahco3，25 mm Nahco3，1.25 mm NaH2pO4，1.25 mm NAH2PO4，3 mm mgmgcl2和0.1 mmmmmmgcl2和0.1 mmmmmmmmmmcl2。After cutting, slices were incubated for 30 min in warm (30 °C) oxygenated (95% O2 and 5% CO2) recovery ACSF containing: 100 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 25 mM glu​​cose, 25 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM sucrose, 2 mM MgCl2 and 1 mM CaCl2 before being allowed to equilibrate at room temperature for另外30分钟。

　　将切片转移到录音室中，并用氧化，加热（28–30°C）摄入ACSF含有：125 mm NaCl，2.5 mm KCl，25 mm葡萄糖，25 mm Nahco3，1.25 mm Nahco3，1.25 mm NaH2PO4 NAH2PO4，1MM MMMGCL2和2 mm MGCl2和2 mm Mm Cacl2。将NBQX（10 µM）用记录ACSF灌注，以防止突触反应实验中AMPAR介导的电流。在GABA粉扑实验中，将四毒素（0.5 µM）灌注，以防止神经元动作电势触发。使用配备DIC光学器件（Olympus BX51WI）的显微镜可视化细胞。记录贴片移液器中装有基于CSCL的移液器解决方案，其中包含：150 mM CSCL，5 mM EGTA，1 mM MGCL2、10 mM HEPES，2 mM ATP和0.3 mM GTP，pH 7.3。贴片电极的电阻为4–5MΩ。移液器解决方案还包含Alexa 568（50μm），以通过染料填充在全细胞记录中可视化细胞，并将记录的切片进行固定并染色以确认细胞类型。将gramicidin A（60μgml -1）添加到移液溶液中以进行穿孔斑块记录。当获得大约30mΩ的访问电阻在达到GIGASEAL电阻后大约30分钟时，将其视为令人满意的。在穿孔贴片记录期间，Alexa 568染料从移液器中泄漏到单元中，表明膜受损，并丢弃了此类记录中的数据。计算每个单个单元的Egaba并平均。In the negative chloride load experiments and in neuronal recordings, recording patch pipettes were filled with CsMe-based pipette solution containing: 135 mM CsMeSO4, 12 mM HEPES, 8 mM NaCl, 0.25 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 2 mM ATP, 0.3 mM GTP and 5 mM phosphocreatine, pH 7.3.将胶质瘤细胞夹在-70 mV的保持电位下。对于所有全细胞贴片夹实验，串联电阻小于30MΩ。用连接到ISO-FLEX刺激隔离器（A.M.P.I.）的双极电极唤起突触反应。 从修补的异种移植细胞中放置100–200μm。低强度的刺激，足以引起一致的响应但不高的刺激，以0.1 Hz的频率使用。通过粉扑移液器应用了记录ACSF中的GABA（1毫米），该粉扑离子离斑块的细胞约100μm，并由Picospritzer II（Parker Hannifin Corp.）控制。使用PE-4000照明系统（COOLLED）的598 nm LED实现了中间神经元的光遗传学刺激。在没有抑制剂（例如NBQX）的情况下，用5 ms的蓝光脉冲对急性海马切片中的中间神经元进行了光遗传学刺激。用多键700B放大器（分子设备）获取信号，并用Axon Digidata 1550b（分子设备）或Instrutech Lih 8+8数据采集设备（HEKA）以10 kHz数字化。使用PCLAMP 11软件套件（分子设备），Axograph X（Axograph Scientific）和/或Igor Pro 8（WaveMetrics）记录数据并分析数据。对于代表性的痕迹，为了清楚起见，已删除了突触反应之前的刺激伪像。使用NERNST方程计算细胞内氯化物浓度。在NBQX存在下，从对SU-DIPG-VI细胞中对刺激的反应进行了上升时间，衰减时间和突触延迟。将上升时间计算为从每个单元的平均响应的可分离发作中测量的峰值响应的10％至90％的时间。衰减时间定义为每个单元的平均响应的单指数衰减时间常数。突触延迟是从0.5 ms刺激到视觉上可见的响应开始的时间的时间。

　　用于电生理学的药物和毒素为野毒素（50 µM； Tocris），四毒素（0.5 µm； Tocris），NBQX（10 µm; Tocris），D-AP5（100 µM; Tocris），Bicuculline（Tocris），Bicucucline（10μm，Tocris），bumetanide（10μm，bumetanide;Lorazepam（10μM； Hospira）。当用于体外切片时，在蒸馏水或二甲基硫氧化物（DMSO）中将药物作为库存组成，并在暴露于切片之前溶于ACSF中的最终浓度。DMSO的最终浓度小于1％。

　　用1–4％的异氟烷​​麻醉动物，并放置在立体定位仪中。对于光遗传刺激实验，1 µL AAV8-DLX5/6-CHRMINE :: MCHERRY49（病毒滴度为1.19×1012；斯坦福大学的K. Deisseroth的礼物）单方面使用Hamilton Neurosyring和Stoelting storeertting storeertaxic Indientor超过5分钟。将病毒载体注射到坐标的右半球的海马CA1区域：1.5 mm横向至中线，-1.8毫米，到核酸脑后部-1.8 mm，颅面深-1.3 mm。病毒注射后两周，如上所述对SU-DIPG-XIII-FL细胞进行异种移植。肿瘤植入7周后，将视觉套圈放在右半球海马的CA1上方，侧线为1.5毫米至中线，-1.8毫米，到Bregma后部为-1.25 mm，深到颅面。

　　在病毒载体输送后，异种移植后8周和光学伪造物植入后1周，至少进行光遗传刺激。将动物自由移动的动物连接到带有单纤维贴片线的595 nm纤维耦合激光系统。从40 Hz频率，10毫秒的光脉冲宽度和光纤维尖端的光功率输出为10-15 mW的循环中进行光遗传学刺激，持续30 s，然后在30分钟内恢复90 s。会议之前，将动物注射为40 mg kg-1 EDU（5-乙基-2'-脱氧尿苷； E10187，Invitrogen），并在疗程前24小时灌注增殖分析后的24小时，在脑媒体中表达FOS刺激后90分钟后，灌注90分钟。

　　用腹膜内avertin（三纤维乙醇）麻醉动物，然后用20毫升PBS心情心灌注。在4°C的4％多聚甲醛中固定大脑，然后转移至30％的蔗糖进行冷冻保护。然后将大脑嵌入到组织螺纹的O.C.T.中。（Sakura），并使用滑动的微型集团（Microm HM450; Thermo Scientific）在40 µm处冠状平面。

　　对于免疫组织化学，将冠状切片在室温下在阻塞溶液（3％正常驴血清，TRITON X-100）中孵育1-2小时。鸡抗GFP（1：500; ABCAM），小鼠抗人核克隆235-1（1：100; Millipore），兔抗KI67（1：500; ABCAM），豚鼠抗抗VGAT（1：500; Sentaptic Systems），突触系统），突触ABCAM），小鼠抗GAD67（1：500; Millipore Sigma），兔抗H3K27M（1：500; Millipore）或鼠标抗FOS（1：500; Santa Cruz Biotechnology）在抗体稀释液中稀释（1％正常的驴子在0.3％triton x-100 triton x-100中），并注入了4 by 3 in cy 3 in triton triton x-100 in thefibibody溶液中。Sections were then rinsed three times in TBS and incubated in secondary antibody solution containing Alexa 488 donkey anti-chicken IgG, Alexa 488 donkey anti-rabbit IgG, Alexa 594 donkey anti-mouse IgG, Alexa 594 donkey anti-rabbit IgG, Alexa 647 donkey anti-mouse IgG, Alexa 647 donkey抗兔IgG和Dylight 405 Affinipure驴抗Guinea Pig IgG在4°C稀释剂中使用1：500（杰克逊免疫研究）持续2小时。将部分在TBS中冲洗三次，并用延长的金固定培养基（生命技术）安装。

　　根据CLIA认证的方案，在斯坦福大学临床病理实验室的5 µM FFPE样品中，对H3K27M抗原的人体尸检样品免疫组织化学进行了。

　　对于免疫细胞化学，将固定的盖玻片在室温下孵育（在TBS中为3％的正常驴血清和0.3％Triton X-100）孵育30分钟。Primary antibodies chicken anti-neurofilament (H+M; 1:200; Aves Labs), guinea pig anti-synapsin1/2 (1:500; Synaptic Systems), mouse anti-nestin (1:500; Abcam) and rabbit anti-GFP (1:500; Novus Biologicals) were diluted in the antibody diluent solution (1% normal donkey serum in TBS) and incubated在4°C下过夜。Coverslips were washed three times with TBS and incubated with secondary antibodies Alexa 594 donkey anti-chicken IgY (1:500; Jackson ImmunoResearch), DyLight 405 donkey anti-guinea pig IgG (1:500; Jackson ImmunoResearch), Alexa 647 donkey anti-mouse IgG (1:1,000; Jackson ImmunoResearch) and Alexa 488在室温下，驴抗兔IgG（1：1,000;杰克逊免疫搜索）在45分钟内。用TBS将盖玻片洗涤3次，并用延长的金抗固定剂（Invitrogen）安装。

　　使用×63油浸入物镜（突触点击成像），×40油浸入物镜或×20空气物镜的空气目标获取图像。使用Imaris（V10.0.0）软件处理3D图像重建。异种移植物内的细胞定量是由对实验条件蒙蔽的研究者进行的。

　　使用ImageJ（v2.1.0/1.53C）分析共聚焦图像并量化共聚焦图像。对于KI67分析，从30次40μm冠状切片相对于整体肿瘤负担，从连续的3个部分中的每一个中选择了3个用于定量的领域。在每个场中，对所有人类核抗原（HNA）阳性和GFP阳性肿瘤细胞进行了量化，以确定定量区域内的肿瘤负担。然后，评估HNA阳性细胞与Ki67共贴贴。为了计算增殖指数（每只小鼠的增殖肿瘤细胞的增殖百分比），将与KI67共同标记的所有区域的HNA阳性细胞总数除以量化的所有区域计数的细胞总数（KI67+/HNA+）。

　　用MBF Zeiss AxiooCam光学显微镜可视化GAD67的GABA能中神经元免疫阳性。只有那些明确标记了soma的细胞。HNA用于标记异种移植的患者衍生的DMG细胞。通过使用立体调查器软件（MBF Bioscience，版本2023）来确定单元格数。通过从c尖到大脑表面的垂直线上画一条垂直线，从此点，从这个点到中线，在带有可见的call体的部分中定义了感兴趣的额叶皮层区域。然后将这些线的终点沿皮质边缘连接，以描绘额叶皮层，包括内侧前额叶皮层和运动皮质。该方法始终在所有部分中应用。以×2.5的放大倍数追踪切片，并以×40的速度从感兴趣区域的6个串行切片中的1个×40获取（每只动物3-4个切片）。确定立体论参数，以确保每只动物至少计数100-300个细胞，而Gunderson M = 1误差系数小于0.1。采样网格大小设置为250×250μm；计数框架设置为100×100μm。在每个实验中成像的所有样品中，暴露时间保持均匀。

　　DMG tumour neurosphere cultures SU-DIPG-VI, SU-DIPG-XIII-FL and SU-DIPG-50 were generated as previously described3,7 from early post-mortem tissue donations and grown as tumour neurospheres in defined, serum-free tumour stem media, consisting of 1:1 mixture of neurobasal(-A) (Invitrogen) and D-MEM/F-12(Invitrogen), HEPES buffer (Invitrogen), MEM sodium pyruvate (Invitrogen), MEM non-essential amino acids (Invitrogen), GlutaMAX-1 supplement (Invitrogen), B27(-A) (Invitrogen), human bFGF (20 ng ml−1; Shenandoah), human EGF (20 ng ml−1;Shenandoah），人类PDGF-AA（10 ng ml-1; Shenandoah），PDGF-BB（10 ng ml-1; Shenandoah）和肝素（2 ng ml-1;干细胞技术）。

　　将十万个胶体瘤细胞用聚赖氨酸（Sigma）（Sigma）在37°C下预处理1小时，然后在37°C下用10 µg mL-1天然小鼠层粘连蛋白（Thermo Fisher）在37°C下进行预处理1小时。将二甲基亚硫氧化二甲基磺胺（Sigma-Aldrich）或以指示的浓度（溶解在二甲基亚氧化二甲基亚氧化物中）的药物添加到盖玻片中。将EDU（10μm）添加到每个盖玻片中。24小时后使用4％多聚甲醛在PBS中固定细胞，并使用Click-It EDU套件和方案（Invitrogen）染色。然后，通过使用共聚焦显微镜将EDU标记细胞的分数定量DAPI标记的细胞来确定增殖指数。

　　使用PRISM（v9.1.0; GraphPad）软件进行统计测试。通过Shapiro -Wilk正态性测试证实了高斯分布。对于参数数据，使用Dunnett的事后测试进行了未配对的两尾学生的t检验或单向方差分析，以检查成对差异和/或线性对比的测试，如图传说中所示。配对的两尾学生的t检验或重复测量单向方差分析与Dunnett的事后分析用于同一细胞的电生理实验。简单的线性回归分析用于确定当前 - 电压关系实验中的X截距。两尾对数秩分析用于分析Kaplan-Meier生存曲线的统计显着性。在图传奇和补充表1中报告了统计测试结果。至少三只小鼠用于体内实验，每个测试组使用至少三个独立的体外实验盖板，以达到80％的功率，以检测出显着性水平为0.05的20％的效应大小。回顾性患者数据的统计分析如上所述。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。