使用以下媒体和缓冲区并准备如下。Luria-Bertani（LB）培养基：10 G L-1 Bacto-Tryptone，5 G L-1酵母提取物，10 G L-1 NaCl;在120°C下20分钟的高压灭菌。酵母肽葡萄糖腺嘌呤（YPDA）：20 g l -1葡萄糖，20 g l -1肽，10 g l -1酵母提取物，40 mg L -1硫酸腺苷硫酸盐；在120°C下20分钟的高压灭菌。山梨糖醇培养基（SORB）：1 m山梨糖醇，100 mm乙酸锂，10 mm Tris pH 8.0，1 mm EDTA;过滤灭菌（0.2 mm尼龙膜，热科学）。板混合物：40％PEG3350，100毫米乙酸锂，10 mm Tris-HCl pH 8.0，1 mm EDTA pH 8.0;过滤灭菌。恢复培养基：酵母肽葡萄糖（20 g l -1葡萄糖，20 g l -1肽，10 g l -1酵母提取物），0.5 m山梨糖醇。过滤灭菌。没有尿嘧啶（SC-ura）的合成完整培养基：6.7 g l-1酵母氮基碱，没有氨基酸，20 g l-1葡萄糖，0.77 g l-1完整的补充混合物脱落，没有尿嘧啶；过滤灭菌。没有尿嘧啶，蛋氨酸和腺嘌呤（SC-ura/met/ade）的合成完整培养基：6.7 g l-1酵母氮基碱，没有氨基酸，20 g l-1葡萄糖，0.74 g l-1完全补充补充混合物脱落，没有尿氨酸，腺嘌呤和甲基氨酸；过滤灭菌。竞争介质：SC-ura/MET/ADE+200μgml-1甲氨蝶呤（加拿大Bioshop），2％DMS​​O。DNA提取缓冲液：2％Triton X-100，1％SDS，100 mM NaCl，10 mM Tris-HCl pH 8，1毫米EDTA pH 8。

　　构建了两个通用质粒，能够通过BindingPCA或AbundancePCA测定任何感兴趣的蛋白质：结合PCA质粒（PGJJJ161）和AbundancePCA质粒（PGJJJ162）。

　　结合PCA质粒（PGJJ161）和丰度PCA质粒（PGJJ162）源自先前的BindingPCA质粒（PGJJ001）和先前的grancepca质粒（PGJJJ045）13。DHFR3的C末端（GGGGS）4连接器已更改为N末端，这使我们能够在丰度和结合PCA分析中融合DHFR3片段的N末端。

　　本文使用了一种KRAS rundancePCA质粒，7个结合PCA质粒，1个结合PCA共表达RasGAP（人RASA1的催化结构域）质粒和一个KRAS诱变质粒。为了构建Kras AbundancePCA质粒（PGJJ271），使用引物对OGJJJ231/OGJJJ232（补充表1），使用质粒（188个氨基酸）的序列（188个氨基酸）放大。该底漆对还引入了Hindiii和NHEI限制位点。PCR产物被Hindiii和NHEI消化，然后使用T4连接酶（NEB）克隆到消化的PGJJ162质粒中。为了构建7 KRAS结合PCA质粒，通过将Hindiii和NHEI消化的全长KRAS序列与消化结合PCA质粒消化的全长KRAS序列结合来构建常见的Kras BindingPCA质粒（PGJJ317）。7结合PCA质粒是通过连接每个结合伴侣PCR产物来构建的，Bamhi和spei使用T4连接酶（NEB）消化了PGJJ317。为了构建RAF1 BindingPCA质粒（PGJJ336），使用引物对OGJJ74/OGJJJJ307从293 T细胞系的cDNA中扩增了Raf1-RBD（52-131）的序列，该序列还介绍了BAMHI和SPEI限制性点。为了构建PI3KCG结合PCA质粒（PGJJ565），使用Primer Primer Primer Parer Paik3CG（Addgene）从R777-E169 HS.PIK3CG（ADDGENE）中扩增Pik3CG RBD（203-312）的序列（203-312）。为了构建Ralgds BindingPCA质粒（PGJJ400），使用引物对OWCC28/OWCC29，从R777-E169 HS.PIK3CG（ADDGENE）从R777-E169 HS.PIK3CG（Addgene）放大了Ralgds RBD（778-864）的序列。为了构建SOS1结合PCA质粒（PGJJ541），使用引物对OWCC149/OWCC150从质粒R777-E317 HS.SOS1（ADDGENE）中扩增SOS1（564–1049）的序列（564–1049）。为了构建DARPIN K27 BINDINGPCA质粒（PGJJ553），使用引物对OWCC157/OWCC158从质粒PCASP-SPTP120-K27-HILA（ADDGENE）中扩增DARPIN K27的序列。构建DARPIN K55 BINDINGPCA质粒（PGJJ554）， 使用引物对OWCC159/OWCC160从质粒PCASP-SPTP120-K55-HILA（addgene）中扩增DARPIN K55的序列。为了构建全长RAF1 BindingPCA质粒（PGJJ623），从IDT（Intectated DNA技术）使用引物对OWCC252/OWCC253合成的基因块（氨基酸1至648）的全长RAF1（氨基酸1至648）的序列。To construct the BindingPCA co-expression RASGAP plasmid, the cyc1 promoter-driven RASGAP cassette was amplified in four fragments, cyc1 promoter from AbundancePCA plasmid (pGJJ271) using primer pair oWCC182/oWCC183, two fragments of RASGAP (amino acids 714 to 1047) were amplified from ORFeome plasmid（81020C02，蛋白质技术单元，CRG）使用底漆对OWCC184/OWCC97和OWCC96/OWCC129，CIC1终结剂从braundancepca质粒（PGJJ271）使用Primer Primer Primer Primer Par CCC128/OWCC140进行了50次rgibson，从而从含量（PGJJ271）从grundancepca质粒（PGJJ271）扩增，该量1小时，由ngomiv消化的RAF1-RBD结合PCA质粒（PGJJ336）。为了构建KRAS诱变质粒（PGJJ380），首先构建了PGJJ191质粒，其中含有链霉素耐药基因盒。PGJJ191质粒在两个片段中放大：一个ORI盒，它也使用引物对OGJJJJ308/OGJJJJ309包含AVRII和Hindiii限制位点，使用Primer Primer Painer Pair Pair Primer Pair Primer Primer Pair ogjjj310/Ogjjj311，由GIIB组成了1组HERSED ATHER RESSIDER，该链霉菌抗菌抗性基因盒使用Primer Primer Painer Paine Cassette进行了反应。KRAS序列由Avrii和Hindiii从含量质粒中消化，并连接到消化的PGJJ191中。然后使用引物对OWCC51/OWCC52引入BBVCI限制性网站。

　　在本研究中使用了基于质粒的一盘饱和度（缺口）诱变方案14。KRAS分为三个块，以便通过Illumina配对150 NextSeq管道对其进行完全测序。

　　获得了最初的单轮划痕诱变，使用脱位KRAS引物的等摩尔混合物（补充表2），有两个原因：（1）获得随机的单个突变体，以用作另一轮入字诱变的模板（通过随机选择单个菌落并通过Sanger测序进行了验证）；（2）量化退化的底漆位置偏置并在浅双突变库中补偿它。

　　为了构建三个最终的KRAS文库，将每个块和野生型的单个突变体的等摩尔池用作一轮划痕诱变的质粒模板。The mutants were chosen based on their varying binding affinities to RAF1 (refs. 18,19), ensuring a range of affinities within the mutant pools (block 1: T2K, V14S, L6H, E37G, Y40A, D38C, L19P, Q61L, E63V; block 2: I84L, F82S, L113F, Y71F,K101R，A66P，M72G，F78W，E63V，V112N;此外，在第1块中还包括了感兴趣的突变体（G12C，G12D，G12V，S17N和T35）。为了补偿极端的位置偏见，每个诱变引物在这些第一轮刻痕库中的平均读数中均与每个位置的平均读数混合在一起。

　　将MIDI PREP的图书馆用Hindiii和NHEI限制性酶消化，并将包含突变蛋白的插入物被纯化（Minelute Gel提取试剂盒，Qiagen，Qiagen），然后克隆到含量循环中，以通过温度周期循环将其克隆到丰度PCA质粒和结合PCA质粒中。Hindiii和Nhei酶消化了含量PCA质粒和结合PCA质粒，并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒（Qiagen）纯化。根据制造商的协议，使用T4连接酶（新英格兰Biolabs）的温度循环连接，通过温度循环结扎进行了bundancePCA库和BindingPCA库的组装，根据制造商的协议，67 FMOL的骨链和200 fmol的插入物在33.3μl反应中。通过透析使用膜过滤器将连接脱水1小时，然后使用SpeedVac浓缩器（Thermo Scientific）浓缩3.3倍。

　　根据制造商的协议，将所有浓缩的组装库转换为NEB10β高效电位大肠杆菌细胞（补充表3中指定的每个库中使用的体积）。允许细胞在SOC培养基（NEB10β稳定出生培养基）中恢复30分钟，然后用氨苄青霉素4×过夜转移至200 mL Lb培养基。每个文库的估计转化子的总数可以在补充表3中找到。第二天早晨收集了每种饱和大肠杆菌培养物的一百毫升，以使用Qiafilter质粒MIDI试剂盒（Qiagen）提取质粒文库。

　　甲氨蝶呤选择测定方案在先前的研究中描述了13。根据每个库的靶向数量，高效酵母转化方案的缩放量表。如补充表3所述，下面描述的转换方案（调整为175 mL YPDA的预培养）的体积缩放或下降。

　　对于每个选择测定法（3个块×6个bindingpca+3个块×1个bundancepca），在30°C的20 mL标准YPDA中生长了3个独立的By4742的独立预培养，过夜。第二天早晨，将培养物稀释到175 mL预热的YPDA中，光密度为600 nm（OD600）为0.3。将培养物在30°C孵育4小时。生长后，将细胞收集并在3,000g下离心5分钟，用无菌水洗涤，然后用SORB培养基（乙酸锂为100 mm，10 mm Tris pH 8.0，1 mm EDTA，1 m mm sorbitol）。将细胞重悬于8.6毫升的SORB中，并在室温下孵育30分钟。孵育后，将175μl的10 mg ml -1煮沸的鲑鱼精子DNA（安捷伦基因组学）添加到每个细胞中，以及3.5μg的质粒文库中。温和混合后，将35 mL的板混合物添加到每个管中，以在室温下再孵育30分钟。将DMSO（3.5 mL）添加到每个管中，然后将细胞在42°C下热（不时反转管以确保均匀传热）进行热冲击20分钟。热休克后，将细胞离心并重悬于〜50 mL的恢复培养基中，并在30°C下恢复1小时。接下来，再次将细胞离心，用SC-ura培养基洗涤并重悬于SC-ura中（补充表3中的每个库中使用的体积）。通过搅拌均匀化后，将10μl放在SC-ura培养皿上，并在30°C下孵育约48小时以测量转化效率。独立的液体培养物在30°C生长约48小时，直到饱和。在补充表3中可以找到每个库分析中获得的酵母转化体的数量。

　　对于每种结合PCA或丰富的PCA分析，在酵母转化后立即进行每个生长竞赛。在转变后质粒选择的第一个循环之后，通过在饱和培养的启动OD600 = 0.1处接种SC-ura/met/ade进行第二个质粒选择循环（输入）（补充表3中指定的每个实验的体积）。在200 rpm的恒定搅拌下，将细胞在30°C下生长4代（补充表3中指定的每个实验的选择时间）。这使突变体的库得以扩增并进入指数增长阶段。然后，通过将输入周期的细胞接种到竞争培养基（sc-ura/met/ade+200μgml-1甲氨蝶呤）来开始竞争周期（输出），以使起始OD600为0.05。为此，收集了足够的细胞，以3,000 rpm离心5分钟，并重悬于预热的输出培养基中。同时，每个输入重复培养物分为两分，并通过在4°C下5,000克离心5分钟收集。用水洗涤酵母细胞，沉淀并在-20°C下储存，以进行以后的DNA提取。在约4代竞争周期后，每种输出复制培养物分为两分，并在4°C下以5,000克离心5分钟收集，用水两次洗涤并固定在-20°C下。

　　先前描述了所使用的DNA提取方案13。下面描述了50 mLOD600≈1.6的培养物。将细胞颗粒（每个实验输入或输出重复一个）重悬于1 mL的DNA提取缓冲液中，通过干冰乙醇浴冷冻，并在62°C的水浴中孵育两次。随后，加入1 ml苯酚：氯仿：氯仿：25：24：1（在10 mM Tris-HCl中平衡，1 mM EDTA，pH 8）与1 g酸洗涤的玻璃珠（Sigma Aldrich）一起，将样品旋转10分钟。将样品在室温下以4,000 rpm离心30分钟，然后将水相转移到新管中。同一步骤重复了两次。将三个摩尔钠（0.1 mL）和2.2 mL预冷的绝对乙醇添加到水相中。将样品轻轻混合并在-20°C下孵育30分钟。之后，将它们全速离心30分钟，以使DNA沉淀。除去乙醇，并在室温下允许DNA颗粒干燥过夜。将DNA颗粒重悬于0.6 mL TE 1×，并用5μLRNASEA（10 mg ML -1，Thermo Scientific）在37°C下处理30分钟。为了脱盐和浓缩DNA溶液，使用了Qiaex II凝胶提取试剂盒（50 µL QIAEX II珠）。将样品用PE缓冲液洗涤两次，并用125 µL的10 mM Tris-HCI缓冲液洗脱样品，pH 8.5，然后将两个授权组合在一起。最后，使用引物对OGJJ152/OGJJ153在总DNA提取物（也包含酵母基因组DNA）中的质粒浓度（也包含酵母基因组DNA），该质粒浓度与质粒的ORI区域结合。

　　先前描述了测序库制备方案13。测序文库是在两个连续的PCR反应中构建的。第一个PCR（PCR1）旨在通过在适配器和感兴趣的测序区域之间引入框架切换碱基，从而扩大感兴趣的突变蛋白质并提高第一个测序碱基的核苷酸复杂性。为了添加Illumina适配器的其余部分和反复索引索引，必须使用第二个PCR（PCR2）。

　　为了避免PCR偏差，每个独立样品的PCR1（任何酵母分析的输入/输出重复）的质粒模板超过20–50倍，比每个样品的预期测序读数高20-50倍。每种反应最大为每微升PCR1的1.25×107模板质粒分子，避免引入更多干扰PCR反应效率的酵母基因组DNA。由于这个原因，按照补充表3的规定，将PCR1缩放为数量。使用Q5热启动高效率DNA聚合酶（新英格兰BioLABS）根据制造商的协议进行了PCR1反应，并根据25 PMOL的汇总型临时启动（在不同的范围中指定的核心范围）（在不同的范围中指定的核对范围）（在不同的范围中指定的核对范围）（均不独立的核心）（均具有独立性的核心）（是独立性的）（是独立性的）寡核苷酸，补充表1）。PCR反应设置为60°C退火温度，延长时间为10 s，并以15个周期运行。通过每微升PCR1反应添加0.04μl的exosap-it（Affymetrix），以去除多余的引物，并在37°C下孵育20分钟，然后在80°C下灭活15分钟。然后根据制造商的协议，使用Minelute PCR纯化试剂盒（Qiagen）汇总每个样品的PCR并纯化。DNA在EB中洗脱，比PCR1的总体积低六倍。

　　使用热启动高保真DNA聚合酶独立运行每个样品的PCR2反应。使用0.05μL每微片PCR2的先前纯化的PCR1，PCR2的总反应还原为PCR1的一半。在第二个PCR中，将Illumina适配器的其余部分添加到库扩增子中。所有样品的正向引物（5'P5 Illumina衔接子）均相同，而反向引物（3'P7 Illumina适配器）与条形码指数（补充表1中的寡核苷酸序列）不同，随后将它们汇集到了Audplacity中，并将其填充在每个测序中，并将其分配为复制型（随后将它们用于补充量）。PCR2的八个周期在退火温度的62°C和10 s的延长时间下运行。将来自同一样品的所有反应汇总在一起，并在2％琼脂糖凝胶上进行等分试样进行量化。使用Qiaex II凝胶提取试剂盒纯化所有样品。在CRG基因组核心设施中，将纯化的扩增子库池进行Illumina 150 BP配对的NextSeq测序。

　　使用Dimsum v1.2.9（参考文献41）（https://github.com/lehner-lab/dimsum）处理所有BINDINGPCA和AbundancePCA实验的配对末端测序的FASTQ文件，并使用默认设置进行了少量调整。补充表4包含所有实验的Dimsum适应性估计和相关误差。在这些数据集上运行DIMSUM所需的实验设计文件和命令行选项可在GitHub（https://github.com/lehner-lab/krasddpcams）上获得。在所有情况下，选择了基于相应数量的核苷酸取代（“ FitnessmininputCountany”选项）的自适应最小输入读数阈值，以最大程度地减少与较低级突变体的测序误差诱导的“变体流”相关的读取的分数。

　　使用自定义脚本进一步过滤与所有样品相关的变体计数（来自DIMSUM阶段4的输出），以仅保留具有单个氨基酸取代的那些变体，包括在第三个密码子位置（由NNK编码）或代表高置信背景的氨基酸取代。后者被定义为在至少五个（在总共七个）结合PCA/AbundancePCA实验中观察到至少200次（在不同的双氨基酸变体中）的单氨基酸取代。对于双氨基酸变体，我们要求其中一种组成的单氨基酸变体是高置信背景突变。所有与剩余的单氨基酸变体（可能是PCR和测序误差的结果）相关的所有读数都被丢弃。最后，然后从带有DIMSUM（CountPath选项）的过滤变体计数中获得健身估计和相关错误。

　　我们使用Mochi V0.9（https://github.com/lehner-lab/mochi)22同时将全局机械模型拟合到所有21个DDPCA数据集（7个表型×3个块）上。该软件基于我们先前描述的基因型 - 表型建模方法13，具有其他功能和改进，以易于使用和灵活性。

　　简而言之，我们将单个KRAS PPI建模为三个状态之间的平衡：展开和未结合（UU），折叠和未结合（FU）以及折叠和绑定（FB）。我们假设展开状态和结合状态（UB）的概率可以忽略不计，并且折叠和结合的自由能是加性的，也就是说，与野生型序列相对于所有构成型单个拟南芥相对于残基特异性能量而言，任意变体的总结合和折叠自由能变化仅是与野生型序列相对于野生型序列的总和。此外，我们假设结合能是针对每个结合伴侣的特异性，而折叠能共享或与KRAS固有，也不受给定结合伴侣的身份，存在或表达影响。我们还假设突变对丰度水平的影响主要是由于自由能的变化而产生的。但是，蛋白质丰度可能会受到折叠以外的因素（例如降解或细胞过程）的影响，这可能会偏向自由能估计。

　　我们配置了Mochi参数来指定一个由七个添加性状层（自由能）组成的神经网络结构，即每个生物物理性质一个要推断的生物物理性质（6个结合和1个折叠），以及每个实验一个线性变换层（3个rundancepca和18个BindingPCA Fitnics）。从玻尔兹曼分布函数得出的指定的非线性变换“ TwostateFractionFolded”和“三分法”分别将能量与折叠和结合分子的比例相关联。拟合神经网络的目标（输出）数据包括来自所有21个DDPCA数据集的野生型，单氨基酸替代变体的健身评分。

　　在模型训练期间持有随机30％的双氨基酸替代变体，其中20％代表验证数据，10％代表测试数据。验证数据用于评估训练进度并优化超参数（批量大小）。将最佳的超参数定义为在100个训练时期后导致最小验证损失的最小验证损失。测试数据用于评估最终模型性能。

　　Mochi使用随机梯度下降来优化神经网络的参数θ，基于损失函数L [θ]，基于平均绝对误差的加权和正则化形式：

　　如果Yn和σn分别为变体N的适应性得分和相关的标准误差，则是预测的健身评分，n是批次大小，λ2是L2正则化惩罚。为了惩罚非常大的自由能的变化（通常与极端健身得分相关），我们将λ2设置为代表光正则化的10-6。平均绝对误差是通过适应性误差的倒数来加权的，以使较不自信的健身得分对损失的贡献降低。此外，为了捕获DDPCA适应性估计的不确定性，训练数据被每个变体的适应性误差分布中的随机样本代替。验证和测试数据未改变。

　　使用默认设置对模型进行了训练，即使用ADAM优化算法最大的1,000个时代，初始学习率为0.05。如果与前十个时期相比，Mochi在最近的十个时期没有改善验证损失，则将学习率指数降低（γ= 0.98）。此外，如果最近十个时期的野生型自由能项已经稳定（标准偏差≤10-3），则摩chi会尽早停止模型训练。

　　自由能直接从模型参数计算，如下所示：∆Gb =θbrt和∆GF =θfrt，其中t = 303 K，r = 0.001987 kcal kcal kcal k -1 mol -1。我们使用蒙特卡洛模拟方法估算了模型提取的自由能的置信区间。使用（1）独立的随机训练 - 验证 - 检验拆分的数据，在十个单独的模型拟合之间计算了推断的自由能变化的可变性；（2）从其潜在误差分布中的适应性估计的独立随机样本。自信的推断自由能的变化定义为具有蒙特卡洛模拟的95％置信区间小于1 kcal mol -1。补充表5包含所有结合伙伴突变的推断结合和折叠自由能的变化。

　　KRAS残基1-169融合到N端His6标签中，将TEV蛋白酶裂解位点克隆到PCOOFY31载体中，并使用Q5位置定向的诱变试剂盒（新England Biolabs）产生了变体。将载体转化为大肠杆菌BL21竞争细胞（NEB），并选择单个菌落在含有33μgml-1 kanamycin的Luria-Bertani肉汤（LB）中生长过夜间培养为饱和。十毫升培养物用于接种补充的1 L lb培养物，在24°C至OD600≈0.4，然后在18°C下生长，然后在18°C至OD600≈0.6。用0.5 mM异丙基β-1-甲状腺乳乙酰甲酰胺（IPTG）诱导蛋白质表达，并在18°C下生长诱导的培养物过夜。通过离心（15分钟，3,000g，4°C）收集细胞，重悬于KRAS裂解缓冲液中（20 mM Tris，500 mM NaCl，25 mM咪唑，5 mM MGCL2，2 mMβ-cercapotto乙醇，pH 8），均用Pierease Protease Protease Tables，0.5.5）Thermofisher），0.1 mg ml-1牛胰腺DNase I和1.5 mg ml-1鸡蛋白溶菌酶（均来自Sigma Aldrich），并以1,500 psi的最大压力在乳液FLEX-C5均质器（Avestin）中裂解。通过超速离心（20分钟，40,000g，4°C）去除细胞碎屑，并将清除的裂解物装载在安装在äkta纯色谱系统（均来自Cytiva）上的His-trap快速流柱上。用含有1 M KCl的KRAS裂解缓冲液洗涤柱结合的重组KRAS变体，并在15柱体积梯度上洗脱，其中含有0.5 M咪唑的裂解缓冲液。通过SDS -PAGE分析收集的0.25 mL级分，根据纯度合并，并使用10 kDa MWCO离心滤器（Merck Millipore）浓缩。

　　通过适应先前详细的Method42，可以实现核苷酸交换以加载非水溶性GTP类似物鸟嘌呤5' - [β，γ-imido]三磷酸（GPPNHP，Sigma aldrich）。简而言之，将浓缩的KRAS变体稀释至1.8 mg Ml-1的浓度，最终体积为2.5 ml的GPPNHP加载缓冲液（50 mM Tris，200 mM，200 mM（NH4）2SO4，2SO4，2SO4，2 mMβ-coccapto乙醇，pH 8），含有3 mg的GPPNHP。在4°C的旋转轮中孵育1小时后，将样品通过PD-10列，并用3.5 mL的GPPNHP加载缓冲液洗脱。加入30单位（6μl）的QuickCIP（NEB）以及2 mg的GPPNHP，并将样品在4°C的旋转车轮上再孵育1小时。随后，将MGCL2添加到30 mm的浓度中。

　　Both GDP and GppNHp-loaded samples were concentrated down to 0.5 ml and injected to a Superdex 75 10/300 GL column (Cytiva) equilibrated with SPR buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7.4) and mounted on an Äkta Pure system for size-exclusion chromatography.通过SDS-PAGE评估0.5 mL的纯度，纯度含量≥95％的分数在液氮中闪烁，并存储在-80°C下，直到需要进行SPR测量。

　　RAF1残基56–131以及DARPIN K55残基1-156，融合到N末端双链带标签和3 C HRV蛋白酶裂解位点也被克隆到PCOOFY31中。接种培养物在37°C至OD600≈0.6，用1 mM IPTG诱导，并在37°C生长3小时后收集。在配体裂解缓冲液中清除的裂解物（100 mM Tris，150 mM NaCl，1 mM EDTA，pH 8）被加载在安装在äktaPure System（Cytiva）上的Streptrap XT XT XT XT XT XT预装色谱柱上。用含有50 mM生物素的配体裂解缓冲液逐步洗脱结合的蛋白质，基于SDS-PAGE评估的纯度汇总分数，并使用10 kDa MWCO离心滤波器浓缩。如上所述，以类似的方式进行SPR缓冲液中的尺寸排斥色谱和存储。

　　将样品在冰上融化，以13,000克离心10分钟，转移到新的试管中，并使用纳米旋风（Thermofisher）进行定量。通过表面等离子体共振在BIACORE T200仪器（Cytiva）上评估了KRAS变体对RAS或K55的结合动力学和亲和力，并具有SPR运行缓冲液（10 mM HEPES，150 mm NaCl，0.05％NaCl，0.05％Tween 20，pH 7.2）。测定格式涉及使用链霉菌素（50μgml -1）功能化的S CM5芯片。简而言之，按照Twin-Strep-Tag捕获试剂盒（IBA LifeSciences）提供的说明，使用胺耦合来创建链霉素表面（链球链球菌XT）。在流细胞4上捕获了双感染标记的RAS或K55蛋白构建体，将流细胞3作为减法参考。RAS或K55的捕获水平靶向50至100个共振单元，然后将越来越浓缩的KRAS变体样品流过固定的RAS或K55（50μlmin -1 -1分钟），并允许最多3分钟。每个KRAS变体的浓度系列范围从0.74 nm到60 nm，用于分析与RAS或K55的结合。用60 s的3 m盐烷盐酸盐（50μlmin -1持续1分钟）将捕获表面再生。使用1：1 Langmuir结合模型分析了所有感觉图。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。