补充表1中提供了所有用于生成质粒并用逆转录（RT – QPCR）定量PCR的寡核苷酸列表。

　　哺乳动物表达载体Prk5-MEGFP-HMGB1-WT， - 突变和突变体无斑点在先前的研究中制备了（Addgene，194548，194550和194553）。To generate fsHMGB1-full-length with KS variants C16-to-A, M-to-E&D and 3F-to-E&D (Fig. 1e), cDNA fragments were ordered from Twist Biosciences, PCR amplified and assembled into BsrGI + SalI-digested pRK5-mEGFP-HMGB1-mutant plasmid using the NEBuilder HiFi DNA assembly master mix（NEB，E2621）。Other KS variants (F-to-A, F-to-G, 0F, F12A, F13A, ΔKS 3F, 11G3F3G, KS Shuffled01–10 and ΔKS-TDP43 HP) were constructed by amplifying pRK5-mEGFP-HMGB1-mutant vector with primers flanking the KS sequence, and KS variant inserts were generated as a single-stranded寡核苷酸用于使用Nebuilder Hifi DNA组装主混合物桥接双链，PCR放大载体。

　　为了生成PiggyBac载体，将NPM1的N端EGFP标记的编码序列（Addgene，131818）61克隆到可诱导的CASPEX表达载体的主链中R3575）。从相同的诱导CASPEX表达载体克隆EGFP序列。通过反向PCR引物的悬垂区域将KS变体引入了NPM1的C末端（扩展数据图2E）。

　　通过放大上述Piggybac载体载体的EGFP-NPM1-WT和-KS DNA片段来构建PRK5-NPM1-WT和-KS质粒，并使用aggybac载体向量和片段组装成Agei+sali-Digested（分别使用NEB，R3552和R0138）prk5 backb5 backb5 backb5 beackiL（分别为r0138））（HIFI DNA组装主组合。

　　pRK5-mEGFP-NPM1-TDP43-HP plasmid was constructed by amplifying the NPM1 sequence from Addgene plasmid 131818 and cloned using the NEBuilder HiFi DNA assembly into a backbone of the pRK5-meGFP (Addgene, 18696)63 linearized by restriction digest with BsrGI and AccI (NEB,R0161）。TDP43-HP序列（氨基酸318–343）通过反向PCR引物的悬垂区引入了NPM1的C末端（补充图2F）。

　　GFP-NB表达构建体的初始设计包括与SV40-NLS-（GGGGS）×2-linker-GFP-NB-（GGGGS）×2连接器融合的MCHERRY，然后在PRK5矢量反向链中重复Killswitch肽的0-2重复。为了产生这一点，MCHERRY从PET45-MCHERRY-NPM1矢量（Addgene，194546）31，SV40-NLS-（GGGGS）×2-linker-GFP-NB-（GGGGS）×2-（KILLSWITCH）的cDNA序列放大。本研究使用了GFP-NB35（Addgene，128788）64的滞后16变体。使用Nebuilder HIFI DNA组装大师混合物，将DNA片段放大PCR并组装成Agei+Sali消化的PRK5-MEGFP-HMGB1质粒（Addgene，194550）。

　　由于MCHERRY – GFP-NB融合蛋白对核仁具有意外影响（扩展数据图3A），在MCHERRY和GFP-NB之间引入了两个裂解位点（P2A和T2A），以确保融合蛋白的最小水平，同时使MCHERRY荧光作为reporter aporerter a reporter a reporter a reporter作为GFP-NB表达水平。除非另有说明，否则使用GFP-NB的实验中使用了具有可裂解MCHERRY的纳米机构建体。此外，在T2A和SV40-NL之间引入了HA TAG，因此可以通过免疫荧光验证GFP-NB将GFP-NB定位在靶冷凝物中（扩展数据图3C）。为了产生这些表达矢量，使用引入HA标签的引物在SV40-NLS之前引入HA标签，并使用含有GSG-P2A-GSG-T2A序列的插件来延长PRK5-MCHERRY-GFP-NB载体，从而产生了HA标签HIFI DNA组装主组合。PRK5-MCHERRY-P2A-T2A-HA-TAG-SV40-NLS-NLS-GFP-NB-1×KS，-2×KS，-1×KSF-TO-TO-A和-1×KSF-TO-T-TO-G VECTORS通过扩增MCHERRY-P2A-T2A-HA-TAG序列从上述VECRENCE和GFPRENCE中备用的MCHERRY-P2A-HA-TAG序列产生，并通过以前在上面构建的vpector-NB-NB产生使用Nebuilder HIFI DNA组装主混合物，将矢量和片段组装成Agei+Sali消化的PRK5载体骨架。具有2×ksf-to-a和2×ksf-to-g变体的载体是通过用底漆侧面的引物和2×ksf-to-a和2×ksf-a序列和2×ksf-t-g序列的载体来产生的。混合。对于涉及MCHERRY – RPL18和MCHERRY – SURF6的实验（图3G和补充图5），GFP-NB构建体中的MCHERRY REPORTER被TAGBFP取代。为了产生此载体，通过使用Agei+Sali的消化切除MCHERRY和GFP-NB序列， tagBFP和P2A-T2A-HA-TAG-SV40NLS-GFP-NB序列通过PCR放大，并使用Nebuilder HIFI DNA组装大师组合将其组装回PRK5骨架。TAGBFP序列是E. Schulz实验室的礼物。

　　针对V5-TAG（Addgene，20147565），Alfa-TAG（Addgene，159986）66和VHH05-TAG（Addgene，171570）67的纳米序列序列（Addgene，159986）67被订购为合成DNA。MCHERRY-P2A-T2A-SV40NLS链序列是从先前生成的GFP-NB载体克隆的，并用纳米机构序列与Nebuilder HIFI HIFI DNA组装大师组合组装。在反向PCR引物中，将接头和杀伤力序列引入了纳米型的C末端。

　　V5-TAG，ALFA-TAG或VHH05-TAG融合到EGFP – NPM1的N末端，当将EGFP – NPM1从PiggyBac载体载体中克隆到Agei-agei-agei-agei-age-a和sali-digigested prk5 backbone时，将序列引入正向克隆引物。

　　具有MSFGFP的维修模板在NPM1，TCOF1，HP1α，EWSR1和FUS的N末端的550–900 BP同源臂侧面，SRRM2的C末端被生成PUC19载体后链（NEB，N3041S）。从先前生成的PRK5-MEGFP-HMGB1质粒扩增了MSFGFP（Addgene，194550）。从Twist Biosciences订购了NPM1，HP1α，SRM2，EWSR1和FUS的5'和3'同源臂的DNA片段。TCOF1的同源臂从HCT-116的GDNA扩增。使用NEBUILDER HIFI HIFI HIFI HIFI HIFI DNA组装大师组合，将每个靶基因的修复模板分别用Sali + KPNI（NEB，R3142）或Hindiiii + Bamhi（NEB，R0104和R0136）组装到PUC19载体中。

　　将靶基因N或C末端的GRNA克隆到SGRNA-CAS9表达载体PX458（Addgene，48138）68中，从中将EGFP替换为MCHERRY。PX458主链被扩增为三个单独的片段，从addgene质粒16197469放大T2A-MCHERRY片段，并组装片段以使用Nebuilder Hifi Hifi DNA组件组件来生成PX458-MCHERRY载体。使用DNA寡素（0.1 nmol）将引导RNA克隆到PX458-MCHERRY载体中，这些寡聚在T4 DNA连接酶反应缓冲液（NEB，M0202）中以T4多核苷酸激酶（NEB，M0201）在95°C in 5 mine Aneard of 10 min Aneard of 10°C中的T4 DNA连接酶反应缓冲液（NEB，M0202）在37°C下磷酸化30分钟。在室温下冷却20分钟。使用T4 DNA连接酶（NEB，M0202）将寡聚双链体稀释1：200，将1 µL的寡核双链体连接到50 ng的BBSI消化（NEB，R0539）PX458-MCH质粒中。

　　为了表达N端MEGFP标记的融合量蛋白构建体（图4A），NUP98 :: HOXA9，NUP98 :: DDX10，SS18 :: SS18 :: SSX1，SS18 :: SS18 :: SSSX2，NONO :: thono :: tfefe 3 :: tfe 3和yap yap yap yap sssx1，sssx2，yap yap yap，PAX :: FOXO1从U2OS cDNA放大。除非在补充表1中另有说明，否则首先使用无悬垂的引物进行扩增cDNA。然后使用含有悬垂的吉布森组装反应的悬垂物将PCR产物放大为DNA模板。ews :: fli1是从addgene质粒102813克隆的（参考文献70）。CRTC1 :: MAML2是从Addgene质粒154265（参考文献71）克隆的。NUP98 :: DDX10 MUT2是从合成的NUP98序列中克隆的，从扭曲生物科学通过Gibson连接将其连接到DDX10序列。通过反向PCR引物的悬垂物引入KS序列。然后，将融合癌蛋白使用雾化器HIFI DNA组件克隆到PRK5-MEGFP（Addgene，18696）的骨架中，该骨架是通过BSRGI和ACCI线性化的。

　　为了用EGFP – BRD4 :: NUT产生表达质粒，从上述所述的PRK5-EGFP-NPM1质粒放大了EGFP序列，而BRD4 :: nut Fusion蛋白的cDNA被从addgene质粒171630（ref。49）中放大为两个单独的片段，同时将ks和ksFus revus the Cression the Cression carfus thate csfus Inted Cress ins canfus ins c ins carf ins canf the carf fress。BRD4 :: NUT和EGFP片段被组装成Agei+Sali消化的PRK5矢量骨架（PRK5-MEGFP-HMGB1），使用NEBUILDER HIFI HIFI DNA组装大师组合。

　　对于1,6-己二二醇实验，MCHERRY-P2A-T2A序列通过将其从先前准备好的PRK5-MCH-P2A-T2A-T2A纳米体构建体中克隆来将N端与EGFP – BRD4 :: NUT构建体融合。

　　为了使N端MCHERRY融合到Surf6，RPL18和P300，从先前制备的MCHERRY-P2A-T2A纳米型载体和GGGGSGGGGS接头C-t端子到MCHERRY，将MCHERRY序列克隆到反向引物中。Surf6，Rpl18和P300的编码序列从HEK293T cDNA放大，并使用烟囱HIFI HIFI Assembly Master Mix组装MCHERRY序列将其组装成Agei+Sali digested PRK5主链。

　　为了与CRM1产生C末端MCHERRY融合，从先前制备的MCHERRY-P2A-T2A纳米型载体和GGGGSGGGGS连接器N末端引入了MCHERRY序列。通过使用Nebuilder HIFI组装主混合物，将CRM1的编码顺序从U2OS cDNA放大，并用MCHERRY序列组装到Agei+ACCI消化的PRK5主链中。

　　用BAMHI和XBAI消化CFP-LACI-MCS质粒72，将终止密码子与T4 PNK（NEB，M0201S）磷酸化的prapprys primers一起引入GAPGSAGSAAGGSAIA链接序列。通过用ASISI和BSIWI限制性酶消化CFP-Laci-MCS质粒来生成CFP-LACI-NUT，-nut-KS和Nut-ksf-t-g-g载体，并使用prk5-egfp-brd4 :: nebblys组装的Nebblys Hebbly Hybone hef prk5-egfp-brd4 :: prk5-egfp-brd4 :: drk5-egfp-brd4 :: Nebblys组装。

　　GFP – NUP98 :: KDM5A构建体是通过从质粒中从质粒中限制 - 酶引导的去除质粒来产生的，用于NUP98 :: kdm5a的组成型表达，如前所述56。为了生成GFP – IRES-NUP98 :: KDM5A – KS/KSF-TO-TO-TO-TO-TO-TO-TO-G-G-G-G构建体，KS从OE_KS/F-TO-TO-TO-TO-A/F-TO-G-MEGFP放大，并在框架中引入GFP-Nup98 :: kdm5a vector。将TRE3G-MCHERRY-P2A-NB-KK克隆到慢病毒进入载体中。逆转录病毒质粒PCMV-GAG/POL是从细胞Biolabs获取的。

　　为了产生含有C端标记的52K融合蛋白的哺乳动物表达质粒（图5D-H和补充图11d），质粒骨架通过限制性摘要线性化，完整的质粒将使用Gibson Assemenbbly Master Master Mix的gibson组成的质粒重新组合，并根据Gibson组成的组合（Neb）（Neb）（Neb）（ne2611）。所有限制性酶均购自新英格兰Biolabs，与Rcutsmart Buffer（NEB，B6004S）中的消化反应兼容。使用FragmentGene服务购买了与Azenta Life Sciences的双链DNA相对应的基因片段（补充表1）。为了克隆GFP标记的融合蛋白（图5A和补充图11A），从通过BSRGI（NEB，R3575）和相通的KS基因片段从p52k-GFP57组装质粒。为了克隆无GFP标签的融合蛋白，用NHEI（NEB，R3131）和SALI（NEB，R0138）限制酶消化了P52K57，以消除现有的52K开放式阅读框架并线性化质粒。使用特定的引物，对编码52K的开放式阅读框架编码52K，缺少终止密码子和包含吉布森组装所需的互补序列。使用消化的主链，PCR放大开放式阅读框和相应的KS基因片段进行三片碎片组件。先前描述了编码GFP标记的小衣壳蛋白IIIA的哺乳动物表达质粒57。

　　For the purification of msfGFP labelled fusion proteins (Fig. 1f, Extended Data Fig. 7 and Supplementary Fig. 1) we amplified the msfGFP sequence from previously generated pRK5-mEGFP-HMGB1 plasmid (Addgene, 194550) for msfGFP, msfGFP–KS, msfGFP–KSF-to-G and msfGFP–NPM1.从pHCRED-NPM1WT-C1质粒扩增NPM1序列（Addgene，131818）。使用Nebuilder HIFI DNA组装主混合物，将放大的基因片段克隆到通过用PMLI和BSRGI线性化的PET22B-BACKBONE（ADDGENE，166439）。

　　以前产生了含有全长纳米绿绿色的质粒58。将KS和KSF-TO-G对照肽序列克隆到纳米杂种的C末端。根据制造商的说明，这些质粒被用作使用SP6 MMESSAGE MMACHINE在体外转录试剂盒（Invitrogen AM1340）合成RNA的模板。

　　在标准条件（37°C和5％CO2）中培养细胞，在TC处理的，非硫化，多义，聚苯乙烯组织培养皿（Corning）中培养细胞。U2-OS（ATCC，HTB-96）HEK293T（ATCC，CRL-3216），HCT-116（ATCC，CCL-247），MCF7（ATCC，HTB-22），C2C12，C2C12（ATCC，CRL-1772），CRL-1772，Lenti-X 293T（Lenti-X 293T）（lenti-X 293T（takara Bio，632180）（632180）和632180（takara Bio，632180）CLS，300454）在DMEM谷氨酸（Gibco，31966047）中培养细胞系。在IMDM（Gibco，12440053）中培养HAP1-SRM2TR0（参考37）和TC71（DMSZ，ACC516）细胞。在RPMI 1640培养基（Thermo Fisher Scientific，61870036）中培养了H3122（CLS，300484）和1765-92（由P.Åman赠与）。所有培养基包括10％FBS（Gibco，10438-026）和100 U ML-1青霉素 - 链霉素（Gibco，15140148）。

　　对于涉及52K和KS变体表达的实验，HEK293（ATCC，CRL-1573）和HEK293T（ATCC，CRL-3216）细胞在DMEM（Corning，10-013-CV）中生长，补充了10％FBS（VWR，89510-186）和1％PENICILIN（GIB） -15140-122）。

　　V6.5 mES cells were cultured on irradiated primary mouse embryonic fibroblasts, previously seeded on 0.2% gelatin-coated plates, in KO DMEM (Gibco, 1082901) containing 15% FBS (Gibco, 10438-026), 100 U ml−1 penicillin–streptomycin, 1× non-essential amino acids (Gibco,11140050），0.05mMβ-甲醇（Gibco，21985023）和实验室纯化的重组白血病抑制因子（LIF）。使用形态学特征验证了所有细胞系的身份，但尚未对线进行认证。

　　所有细胞系都使用Lookout Mycoplasma PCR检测试剂盒（Sigma-Aldrich，MP0035）或PCR支原体测试试剂盒II（Applichem，applichem，a8994）测试了分支机构阴性。在每年至少两次从含有汇合的细胞单层的组织培养皿中取出的0.2-1 mL细胞培养基中进行分枝菌测试。

　　For experiments involving expression of NUP98::KDM5A and KS variants, mouse fetal liver cells were cultured in DMEM/IMDM (50:50%, v/v, Gibco, life technologies), supplemented with 10% heat-inactivated FBS (Sigma-Aldrich), 100 U ml−1 penicillin, 100 µg ml−1 streptomycin, 4 mM- 谷氨酰胺和50 µMβ-羟基乙醇（所有Gibco，Thermo Fisher Scientific）在100 ng ML-1 MSCF，10 ng ml-1 mil-1 mil-3和10 ng ml-1 mil-6（All Peprotech）的情况下。在RPMI 1640（Gibco，Life Technologies）中培养了体内异常的白血病细胞，补充了10％FBS，100 U ML-1 Penicillin，100 µg ML-1链霉素，4 mM-glutamine，-Glutamine，100 ng ML-1 ML-1 MSCF和10 ng-1 ng-ml-1 mil-3。After 1 week, the medium of the ex vivo-isolated cells was switched to RPMI 1640 supplemented with 10% FBS, 100 U ml−1 penicillin and 100 µg ml−1 streptomycin, 4 mM -glutamine, 1 mM sodium pyruvate (Sigma-Aldrich), 50 µM 2-mercaptoethanol (Gibco, Thermo Fisher Scientific) and20毫米4-（2-羟基乙基）-1-1-吡喃吡嗪甲磺酸（HEPES）（Sigma-Aldrich）。通过连续培养建立稳定的细胞系超过4周，并使用RPMI培养基维持GFP – NUP98 :: KDM5A细胞系。在DMEM（Gibco，Thermo Fisher Scientific）中培养铂（Cell Biolabs），HEK293T和Lenti-X 293T细胞（Takara），并补充了10％FBS，100 U ML-1 Penicillin，100 µg ML-1 Penicillin，100 µg ML-1链霉素和2或4 mm-glutamine commine。在生长培养基中，将表达纳米霉素构建体的小鼠白血病细胞和HEK293T细胞与强力霉素（Sigma-Aldrich，24390-14-5）一起在生长培养基中以1 µg mL-1孵育，以诱导表达。对于蛋白酶体抑制作用（图4H – J和补充图9a，b），最初将表达纳米型构建体的鼠白血病细胞与上述3小时的强力霉素一起孵育，以诱导表达。然后用UBA1抑制剂TAK-243（MLN7243）（Medchemexpress，HY-100487）在0.25 µm处处理细胞，NAE抑制剂Pevonedistat（MLN4924）（Medchemexpress，hy-70062） 在1.25 µm和蛋白酶体抑制剂MG-132（Medchemexpress，HY-13259）时为2.5 µm，并在成像之前孵育3小时。在5％CO2和95％的湿度下，将所有细胞在37°C下培养。

　　根据制造商的说明，使用Fugene HD（Promega，e2311），将每孔总共150,000个细胞接种到六孔板上，第二天用500 ng的PRK5-MSFGFP-HMGB1-MUTANT KS变体转染。第二天，使用FACSARIA II仪器（BD）对表达GFP的细胞进行排序，并将每个孔的10,000个细胞接种到96孔板上，并在48小时后使用CellTiter-Glo 2.0试剂测量可行性（Promega，g9242）（图1C和扩展数据图2D）。

　　用MSFGFP生成的维修模板在NPM1，TCOF1，HP1α，EWSR1和FUS的N末端的550–900 BP同源臂侧面，以及SRRM2的C末端在PUC19中的C末端在“ PUC19维修模板”部分中描述了PUC19矢量。线性修复模板DNA片段是通过PCR生成的（补充表1中提供了引物的列表），使用Qiaquick凝胶提取试剂盒（Qiagen，28704）对凝胶提取并纯化。

　　每孔总共将350,000个HCT-116，U2OS，TC71和1765-92个细胞播种到六孔板上，第二天使用Lipofectamine 3000使用Lipofectamine 3000，使用2400 ng的线性化修复模板和600 ng的PX458-MCHERRY-MCHERRY-GRNA质粒转染了2,400 ng。首先，使用转染后48小时使用Facsaria II仪器（BD）选择细胞进行麦克利表达，培养4-6天，然后将表达GFP的细胞分为96孔板上的单细胞克隆。

　　每个井的总共500,000个MES细胞不含种子喂食器。根据制造商的说明，使用脂肪酰胺3000，用4,000 ng线性化的修复模板和1,000 ng的PX-458-MCHERRY-GRNA质粒补充了2×LIF，第二天将细胞转染。首先使用转染后48小时使用Facsaria II仪器（BD）选择细胞进行MCHERRY表达，并在6 cm的盘子上用馈线细胞培养4-6天。将MES细胞菌落手工挑选为带有进料细胞的96孔板。

　　在验证成功地插入两个等位基因后，选择了NPM1，TCOF1，SRRM2和HP1α的纯合子克隆，并且使用补充表1中列出的引物列出了EWSR1的WT等位基因的基因分型。由于补充表1。由于U2OS Cells的复杂karyotype of U2OS Cells of U2OS Cells of U2OS Cells onkok ocking wass oknet oknet oknet oknezyzypous gffp insozy okyzypous gffp。最后，通过蛋白质印迹验证了敲入线的GFP标记的蛋白质。在这项研究中生成的细胞系的基因分型数据包括在补充图2中。13和15。

　　为了生成EGFP – NPM1的强力霉素诱导的过表达系统，我们使用PiggyBac Transposon系统随机整合了NPM1野生型，KS，KSF-TO-G，K​​SF-TO-TO-A和KS0F的编码序列。

　　载体质粒（上文描述）和PiggyBac转座酶表达载体（SBI，PB210PA-1）使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）根据制造商的指令以5：1的摩尔比共转染A673细胞。转染的大量种群通过在转染后24小时添加2μgml -1紫霉素（Gibco）在细胞培养基中添加2μgml -1紫霉素（Gibco），总计5天。然后将存活的细胞用于实验（扩展数据图2E – G）。

　　将带有LACO Array51的U2OS 2-6-3细胞播种在八孔室载玻片上（IBIDI，80826-90），密度为30,000个细胞，并使用Fugene HD和175 ng plasmid per persutions persutions persutions persutions persutions persutions cfp-laci（空对照）或CFP-Laci（空对照）或CFP-Laci-Nut质粒转染。然后，转染后2天，固定细胞并如“免疫荧光”部分中所述进行RNAPII的染色。

　　使用Zen Blue V.3.9软件使用影响区域进行了LACI -LACO绑定测定法的图像分析。使用CFP信号（单击阈值； Valuelower：16600; ValueUpper：65535;扩展：1）检测到LACI-NUT焦点，并将背景区域定义为围绕焦点的环（环距离：5;厚度：厚度：6）。测量了RNAPII的平均CFP强度和ALEXAFLUOR 647强度，并通过将FOCI的平均信号除以背景环元件处的平均信号来计算RNAPII信号的富集。

　　GFP – NUP98 :: KDM5A如先前所述建立了小鼠模型衍生的细胞系56。简而言之，通过逆转录病毒共同转导MSCV – EGFP – NUP98 :: KDM5A与MSCV – RTTA3-RTTA3 – EIRES – NRAS – NRAS（G12D）–EF1A – LUC2的MSCV – EGFP – NUP98 :: KDM5A生成GFP – NUP98 :: KDM5A细胞系。然后，将3.74×106（6.1％GFP+）细胞通过尾静脉注射移植到辐照受辐照的（4,5 Gy）的受体小鼠（C57BL/6，LY5.1）中（图4F）。如前所述，通过全身发光成像监测疾病进展。在疾病发作后将小鼠安乐死，并收集骨髓和脾细胞。通过骨髓细胞连续培养4周，没有补充细胞因子来建立稳定的细胞系。所有动物研究均根据道德动物许可方案进行，并获得奥地利政府的负责当局（BMBWF-68.205/0199-V/3B/2018）批准。为此，使用了10-12周的男性和雌性C57BL/6J.SJL小鼠。在严格的控制标准条件下，在单独通风的笼子中，将小鼠保持在特定的机会性病原体质量（SOPF）中，并以sniff haltungsfutter Chow标准10毫米颗粒（目录No。V1534-000），Ad Ad Adibitum。这项研究不包括任何对动物进行不同治疗队列的实验，基于性别的分析将是相关的。

　　所有活细胞成像实验均使用配备有Plan-Apochromat×63/1.40油差分干扰对比目标的LSM880飞机显微镜进行，同时在37°C和5％CO2下孵育细胞。将细胞以每孔30,000个细胞的形式将细胞接种到八孔腔室载玻片（Ibidi，80826-90）上，24小时后转染，并在转染后24小时成像。使用Fugene HD转染U2OS和HEK293T细胞；根据制造商的说明，HCT-116，TC71，1765-92，H3122和V6.5 MES细胞3000。HOECHST 33342（0.2 µg ML -1，Thermo Fisher Scientific，62249）被添加到细胞培养基中以进行核染色。为了可视化活细胞中的核仁，RFP - 纤维蛋白融合蛋白通过用PtaGRFP-C1-纤维蛋白质粒转染细胞（Addgene，70649）73与MEGFPPPPPPPS-FSHMGB1-FULL长度变体一起表达。

　　为了表达NUP98 :: KDM5A和KS构建体，将HEK293T细胞接种到八孔室载玻片上（Ibidi，80826-90），并培养直至达到70％的汇合。为了转染，在200 µL Opti-Mem I（Gibco，31985062）中混合了1μg质粒DNA和2.5％聚乙烯（Polyscience，26292），并孵育20分钟。然后将混合物滴入每个孔中。过夜孵化后，在实时成像之前将培养基交换为新鲜的预热生长培养基。为了可视化细胞核，将细胞与成像前10分钟的5 µM DRAQ5（Nobusbio，NBP2-81125）孵育。

　　在FRAP实验中，确定了两个关注区域（ROI）：矩形ROI 1和较小的圆形ROI 2，覆盖要漂白的物体。使用488 nm激光器，强度为70-100％，迭代5–20迭代和GFP信号恢复在ROI 2中漂白了GFP信号，使用1-2 s的间隔进行40-60 s测量。对于使用GFP和MCHERRY信号的共卷曲测定，使用561 nm激光器以与GFP信号相同的方式对MCHERRY信号进行了漂白。实验之间的激光强度，迭代次数和ROI的大小各不相同，但在实验中始终相同。Fluorescence intensities were acquired from 6–20 ROIs from separate condensates in each experiment, quantified using ZEN Black v.2.3 and reported as relative values to the pre-bleaching timepoint (Figs. 1b, 2e, 3g, 4b and 5b, Extended Data Figs. 1a, 2f, 3e, 4a, 6f, 8b, 9b, 10b,f, 12c,f and Supplementary Figs. 2d,g,3b，e，h，5b，e，10d，g和12b）。使用GraphPad PRISM9和R Package GGPLOT2生成数字。在使用MCHERRY-P2A-T2A-GFP-NB载体转染的细胞进行的FRAP实验中，使用Hoechst，MCHERRY和GFP通道从ROI 1获取图像，并在核区域内使用MCHERRY信号（由HOECHST信号定义）用于量化MCHERRY表达水平（定义MCHERRY表达水平）。为了量化核TAGBFP强度（补充图5C，F），平均强度是根据手动放置在核仁外核区域的1.4 µm2平方测量的。

　　Nufanci方法是从Fanci Method41中采用的。内源性MSFGFP – NPM1标记的细胞用于Nufanci实验。将600万个细胞铺在10 cm的培养皿中，培养24小时，然后更改培养基，并使用lipofectamine 3000与GFP-NB构建体转染细胞。放线菌素-D处理的细胞用400 nm放线霉素D（Sigma-Aldrich，A1410-2MG）在收集前1小时。然后，转染后24小时，将未转霉素，放线霉素D处理的和GFP-NB转染的细胞胰蛋白酶胰蛋白酶进行胰蛋白酶，然后将其颗粒化为1.5 mL Eppendorf管。将细胞用1 mL 1％甲醛在细胞培养基中的16％甲醛（Thermo Fisher Scientific，28906）稀释的细胞固定，在室温下与旋转的室温下10分钟。通过将1 m甘氨酸（Jena Bioscience，CSS-510）添加到最终浓度为200 mm，在室温下旋转5分钟，从而停止了固定。将细胞用冷PBS洗涤两次，每个PBS在4°C下的自旋旋转3分钟，并将颗粒放在冰上以尽快进行排序，而无需先冷冻细胞。接下来，将固定的细胞分类在BD FACSARIA融合系统上，以从未转染的样品中收集来自转染的样品和MCHERRY-细胞中的MCHERRY+细胞，分为15 mL蛋白叶叶管（Eppendorf，00301222216），带有Facs Faster（2％fbs，2 mM edta，pbs）。分别从转染和未转染的样品中收集了约85万和500,000个事件。将分类的细胞在1.5 mL蛋白叶管中颗粒（Eppendorf，0030108116）。接下来，将颗粒彻底恢复在1 ml裂解缓冲液B0中（50 mM HEPES pH 7.5，150 mM KCl，1％IGEPAL CA-630，完整的蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，11873580001）和phosstop（默克4906837001），均为1，interiation restiond，1米抑制剂（NEB，M0314L）和2 µg ML -1 DAPI。将样品在冰上孵育5分钟， 转移到Covaris Millitube（Covaris，520130），然后使用Covaris E220（PIP：140;占空比：5;持续时间：120 s）进行超声处理。然后，将每个样品的30 µL保留为MS的输入材料。每个样品的其余样品被转移到1.5 mL蛋白叶叶管中，并在BD Facsaria融合系统上排序，其SSC阈值为1000的SSC阈值为1.5 mL蛋白叶块管（排序策略和质量控制在补充图4中显示了。对于核仁分选的门控策略，使用了三个门：（1）使用DAPI（UV-450/50-A）与GFP（B-530/30-A）进行识别，以识别含有核仁的种群（GFP+DAPIINTERMEDIATE），通过对图4C进行分类（通过对4C的补充）进行分类。（2）使用FSC-A与SSC-A门排除大型事件；（3）GFP（B-530/30）与MCHERRY（YG-610/20）用于MCHERRY-（对于未转染的样品和放线霉素D）或MCHERRY+（对于样品NB，KS，KS，KSF-TOR，KSF-GON，KSF-G-G-G和2×KS）。通过与麦克利样品（未转染）进行比较来确定门。收集流式细胞仪数据并使用BD FACSDIVA V.8.0.1进行分析；使用FlowJo进行流式细胞仪数据可视化。从每个样本收集了大约40万事件。将收集的核仁在4°C下以10,000×g离心10分钟，然后用冷PBS洗涤一次。

　　为了进行MS样品制备，将核仁样品提供达到1×缓冲液4（2×缓冲液4：100 mm Tris，pH 7.5、50 mm NaCl和4 mM MGCL2），并在65°C下旋转1,000 rpm在95°C下摇动1 h，然后在95°C下孵育10分钟。然后将每个样品超声在配备Microtip（Bioke，Q4417）的Qsonica Q700超声波器上，幅度为5，为10 s，直到管中没有可见的颗粒。接下来，将每个样品在冰上短暂冷却，然后将苯酶添加到25 U µl-1的最终浓度（Thermo Fisher Scientific，70-746-3），并将样品在37°C下孵育30分钟30分钟，并以1,000 rpm摇动。然后将样品提供以达到1×缓冲液5（2×缓冲液5：6 m GDMCL，20 mM TCEP，80 mm氯乙酰氨酰胺），并在37°C下孵育1 h，并用1,000 rpm摇动。接下来，向每个样品中加入1 ml 1 ml冰冷的100％丙酮，并在-20°C下沉淀过夜。第二天，将样品在4°C下以20,000×g离心10分钟，将上清液丢弃，并用冰冷的100％乙醇洗涤一次样品，并在4°C下以20,000×g离心10分钟；将上清液丢弃，并将颗粒简短地干燥以干燥大多数乙醇，但不能完全干燥。接下来，将输入和核仁样品分别重悬于50 µL 100 mm（NH4）HCO3中。然后将样品在配备有振幅5的Microtip的Qsonica Q700超声器上进行超声处理10 s，直到管中没有可见的颗粒。使用量子蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Q33211），在Qubit 3系统上以重复的两份测量样品的浓度。从每个核仁样品中产生约2 mg的蛋白质（补充表2中概述了Nufanci样品制备质量控制对数）。接下来，用5 ng胰蛋白酶和5 ng lys-c消化每个样品的150 ng，用100 mm（NH4）填充到20 µl的最终体积。HCO3在37°C下过夜，摇动800 rpm。根据制造商的方案，将肽用甲酸将肽酸化为2％和150 ng的消化剂的终浓度为2％和150 ng。通过纳米流相反向液相色谱（Evosep One，Evosep）与Aurora Elite柱（15 cm×75 µm的内径，C18 1.7 µm珠子，Ionopticks，Ionopticks），使用20个样品（每天的20个样品）使用Aurora Elite柱（15 cm×75 µm），对肽分离进行。使用数据依赖性的采集和平行的积累串行片段化方法，将LC系统在线耦合到SCP质谱仪（Bruker Daltonics）。使用Maxquant（V.2.6.6.0； Max Planck生物化学​​研究所）处理MS数据，并针对人UniprotkB蛋白质组（UP000005640; Revision 2024 09 11）进行搜索。相应地使用了补充表1中概述的其他修改序列。NUFANCI和输入样本独立使用了运行和无标签定量特征之间的匹配。MS数据已通过DATASET标识符PXD058854下的Pride合作伙伴Repository74沉积在ProteOmeXchange联盟中。

　　使用Timstof SCP（Bruker）获取MS数据。使用MaxQuant75处理原始峰值文件。分别计算Nufanci和Input的无标签定量（LFQ）值，并在Nufanci和输入之间分别应用运行之间的匹配。Alphastats（V.0.6.9）76用于处理最大输出。将蛋白质组矩阵用作字母的输入，并预处理数据以去除污染物和反向蛋白质。使用ANOVA使用500个可变蛋白进行NUFANCI和输入蛋白质组的主成分分析（PCA），LFQ值进行了标准化（扩展数据图5A）。对于Nufanci子集，使用VST转换矩阵（扩展数据图9B）进行PCA。使用Python v.3.10中的Scipy Package77计算相关图，并用Seaborn绘制（扩展数据图5C）。使用log2转换的LFQ值绘制热图，并使用病房方法通过欧几里得距离聚类，并使用Seaborn绘制（图3B和扩展数据图9E）。使用Seaborn产生蛋白质表达图（扩展数据图9F）。使用Alphastats diff_expression_analysis功能设置为t检验，然后用seaborn绘制（图3C和扩展数据图5G）来计算火山图数据。补充表2中提供了差异检测到的蛋白质基团的列表。

　　肽（R10，R10MMMNKLVLAQFFFSCL和R10MMMMMNKLVLAQGGGSCL）具有N端TAMRA标签，由肽专业实验室合成，并在DMSO中重构为2 mm库存。将GFP – NPM1 U2OS细胞接种到八孔室载玻片（Ibidi，80826-90），每孔的密度为60,000个细胞。第二天，用PBS洗涤细胞两次，并在37°C中暴露于PBS中30分钟的3 µm肽。在细胞培养基中，在0.2 µg ml -1 HOECHST 33342（Thermo Fisher Scientific，62249）的情况下，将孔洗涤一次，然后将细胞保存在37°C孵化器中3小时，然后在细胞培养基中，然后在LSM880显微镜上进行成像。我们注意到，R10对照肽经常存在于细胞质灶中，仅在核仁中很少存在。为了促进R10对照肽的细胞分布，使用HXP灯暴露于德克萨斯州红色滤光灯30 s，然后在图像采集之前等待30 s。R10 – K和R10 – KSF-TO-G的成像是在没有额外照明步骤的情况下进行的。

　　为了分析用细胞渗透肽处理的细胞中的核和核仁TAMRA信号，首先使用OTSU阈值（单击阈值：12，255）和核仁对核进行分割，并根据GFP – NPM1信号（单击阈值：6，255）。测量平均核，核质（外核核）和核仁TAMRA信号强度。

　　对于R10 – KS肽处理的细胞的图像，分别处理用于垂死细胞的Z位，因为聚集的细胞质和细胞外Tamra信号偏向使用最大强度投影。我们注意到，对于TAMRA强度计算，在某些情况下，可以在不同的Z位置检测到核，并且可以计算两次。因此，通过视觉检查计算了垂死细胞的数量，该垂死细胞的数量由小凝结核和增加的Hoechst染色强度指示。图像是从两种生物学重复中获取的，分别包括356、460和511细胞R10，R10-KS和R10 – KSF-TO-G-G。重复进行TAMRA强度测量值（扩展数据图6D）。

　　对于体外NPM1液滴融合测定，将30μM纯化的重组MSFGFP – NPM1与2μM的TAMRA – R10，TAMRA – R10 – KS或TAMRA – R10 – KSF-TO-TO-TO-TO-G-G-G和PCR管中的5％PEG 8000混合。每个液滴的体积为5μL，在存储缓冲液中由0.75μlMSFGFP -NPM1组成（50 mM Tris pH 7.5，125 mm NaCl，10％甘油），0.5μLTAMRA -TAMRA -TAMRA -TAMRA - 肽在DMSO中（DMSO对照条件下DMSO）（DMSO对照条件下DMSO）（DMSO对照条件下只有DMSO），1.25 l.2.25 l.2.25 l. 8000 refly and 2.2.25 l.8000 reptre and 2.20％pe。将所得的5μL移到了腔室盖玻片上（Ibidi，80800）。在幻灯片上的滴度平衡3分钟后，获得图像，其LSM880共聚焦显微镜配备了Plan Apochromat×63/1.40 Na Oil DIC物镜，并带有×1缩放。对于每个视野，时间序列成像捕获300个连续的图像，其时间间隔为0.26。液滴融合事件的定量基于每个条件的三个独立图像系列。

　　液滴融合事件在斐济（V.2.3.0/1.53F）中进行了子跟踪，以包含40个切片，这些切片在液滴融合前捕获了一个切片，在液滴融合过程中捕获了39片。然后，将熔断的液滴转换为二进制掩码，并使用斐济的内置测量功能测量了fusion液滴的ROI，并为每个切片测量fifusion液滴的ROI。如前所述36,46,78,79，计算了纵横比，松弛时间（τ），长度尺度（ℓ）和毛细管速度（η/γ）。简而言之，通过AR =ℓmajor/ℓminor计算熔断液滴的纵横比。纵横比的时间演变适合功能ar = 1+（art0 - 1）×exp（-t/τ），其中t是时间，τ是松弛时间，而art0是第一个时间点的纵横比。融合事件的长度尺度由ℓ=（ℓminor，t0×（ℓmajor，t0 -ℓminor，t0））0.5计算，其中t0表示在第一个时间点处的值。将τ与ℓ的图拟合到形式的τ=（η/γ）×ℓ的线上，以确定反毛细管速度η/γ，即粘度（η）与表面张力（γ）的比率（扩展数据图7）。

　　将每个FRAP ROI的每个时间点的记录荧光强度标准化为第一个时间点的信号强度。在GraphPad和Rstudio中绘制了同一FRAP系列中每个时间点的复制，而误差线代表S.D.

　　通过如上所述，使用以下方程式进行了标准化的信号强度，计算了FRAP ROI的移动部分（图1E和扩展数据图1A，2F和3E）：

　　在Zen Black V.2.3（Zeiss）下，使用×63油物镜在LSM880-Airyscan上获得了活细胞图像。对于每种条件，成像8-31个区域，至少捕获了26个核。在图像分析模块Zen V.3.4（Zeiss）中对所得图像进行了量化。简而言之，在图像中，通过使用自动强度阈值进行平滑后，通过使用核反染色来鉴定核（Gauss，3.0）。通过在微弱平滑（高斯，1.3）和使用滚球算法上施加固定强度阈值，从而在核中分割了核里。将最大GFP区域设置为1,000，并为每个GFP对象提取循环评分（扩展数据图2B）。

　　将原始文件导入Arivis Vision 4D（Arivis），并手动设计了自动分段管道。该管道包括基于基于基于的基于中位数的脱泽，背景校正，细胞的细胞隔板分割，细胞和细胞核，冷凝水的强度阈值分割，粒子发现器和大小以及球形滤波器。分段对象（细胞，核和冷凝物）是手动校对的，并在必要时进行调整。对于图4H所示的数据，根据MCHERRY信号设置了ROI，并且每个条件至少100个单独的单个细胞计算冷凝物和平均GFP强度的数量。用于补充图9C中显示的数据使用了相同的方法，但分析了至少60个细胞。

　　For immunofluorescence experiments performed in GFP–NPM1 knock-in HCT116 cells (Fig. 3h and Supplementary Fig. 6a) and eGFP–BRD4::NUT-expressing cells (Fig. 3g,h and Supplementary Fig. 6g,h), cells were seeded on 8-well or 18-well chamber slides (Ibidi, 80826-90 and 81816) with 30,000 or每孔12,000个细胞，24小时后转染，并在PBS中4％PFA转染后24小时固定10-15分钟。将细胞用0.5％Triton X-100（Thermo Fisher Scientific，85111）在PBS中渗透10-15分钟，在含有1％BSA的阻止缓冲液中孵育，在含有1％BSA（BSA分数V，Gibco，15260037）和0.1％Triton X-100的PBS中，在PBS中孵化了pbs persivation Antigration Antignation Antign Antibe Antive +44.4％triton X-100。Slides were washed five times with blocking buffer, incubated with secondary antibodies (AlexaFluor 647 donkey anti-mouse or anti-rabbit antibodies, Jackson ImmunoResearch, 715-605-150 and 711-605-152, 1:1,000) in blocking buffer for 1 h in room temperature, washed twice with blocking buffer, stained with 0.5 µg ml−1DAPI在PBS中（Invitrogen，D1306），并用PBS洗涤3次。使用了以下主要抗体：5.8S rRNA（Novus，NB100-662SS，1：500），HA-TAG（Cell Signaling，C29F4，1：1,000），Nepro（Santa Cruz，SC-376579，1：100）AB4729，1：1,000）。使用配备有Plan-Apochromat×63/1.40油差分干扰对比度目标的LSM880 Airyscan显微镜进行成像。

　　对于NEPRO的免疫荧光实验（图3D），除样品固定外，所有程序步骤均与上述相同。用于NEPRO免疫荧光的细胞（IF）用在室温下在培养基中稀释的1％甲醛将其固定在载玻片上10分钟，用200 mM甘氨酸溶于200 mM甘氨酸5分钟，然后用PBS洗涤一次，然后用PBS洗涤一次，然后用通透性。

　　如果在52K，52k – ks和52k – ksf-to-a表达细胞中进行的实验（图5G和补充图11D），将细胞在12 mm玻璃盖玻片（电子显微镜科学，72196-12，72196-12）上生长，并在24孔，非生殖，多霉菌，多霉菌素质上生长。对于转基因的瞬时表达，根据制造商的3：1试剂：质粒比率：质粒比例，使用X-三分元HP（Roche，636236001）将哺乳动物表达质粒转染到HEK293T或HEK293细胞中。以1 µg DNA的比率转染质粒：3 µL X-三元HP：4×105个细胞，并相应地缩放或向下缩放或向下缩放。然后，转染后24小时，将细胞固定在PBS中的4％PFA中，在37°C下固定10分钟，然后在PBS中洗涤一次，然后在室温下用0.5％Triton X-100在室温下渗透10分钟。将样品在PBS中的3％BSA中阻塞（+0.05％叠氮化钠）在室温下1小时在PBS中与3％BSA中的一抗在3％BSA中孵育1小时（+0.05％硫代钠）（在室温下1小时）在室温下1 h，在PBS中3％的BSA中（+0.05％sodiub apiium Apiiuim Apiiuim Apiiuim sopium sodium sodium apiiuim sopiuim sopiuim sodium sodium sodium sodium sodium sodium sodium sodium sopiuim a zide）在3％中洗涤3次室温1小时。然后将盖玻片在PBS中洗涤两次，并使用延长的金抗抗试剂（细胞信号技术，9071）安装在载玻片上。使用了以下主要抗体：52K（P.听力80;兔子，多克隆，1：500）和DBP（来自A. Levine81的礼物，鼠标，B6-8，1：400）。Alexafluor山羊抗兔488荧光团偶联的二抗（Life Technologies，A-11008）或山羊抗小鼠488荧光团偶联的二抗（Life Technologies，A-11001）的浓度为1：1,000。使用Leica DMI8 Thunder Imager和LAS X采集软件对盖玻片进行了成像。使用等效设置在斐济（V.1.53F51）中处理图像。使用斐济（V.1.53F51）进行图像分析。分析52K冷凝物中IIIA的富集（图5H） 如下所述，图像分析中描述了。

　　使用ImageJ v.2.14.0/1.54F分析了GFP和核内染色强度之间的Pearson相关系数（图4D，扩展数据图8E和补充图6B）。首先，使用DAPI通道和Analyzeparticles工具上的阈值将核分割为ROI，并收集了ColoC2插件报告的GFP和AF647之间的Pearson的相关系数，并报告了MCHERRY或GFP表达的每个核。DAPI，MCHERRY和GFP通道的阈值在实验之间变化，但在每个实验中阈值图像时保持恒定。

　　GFP-NB – 2×ks表达GFP – NPM1 HCT-116细胞的DE混合和剩余的核仁区域中核酸5.8s rRNA强度的分析（图3i）通过选择MCHERRY+细胞，通过选择GFP – NPM1的脱混合，可以通过imageJ进行imageJ。使用GFP – NPM1强度在0.8 µm2的圆形区域内进行了GFP – NPM1和AF647强度的测量值，如图3H所示。

　　使用ZEN软件和影响分析工具的区域分析了52K冷凝物中GFP – IIIA的富集，以使用点击阈值（值下部：113;值ups：246）和背景为环元素（sementation ZOI ZOI RING距离：3; RING RING厚度：3;环形厚度：3）附近52K对象。对于单个52K焦点，显示了52K缩合在平均背景信号上的平均GFP信号的富集（图5H）。背景GFP强度计算为在52K焦点周围的环元件处的平均GFP信号，并在图5H中显示。

　　如先前所述，BL21（DE3）（DE3）（NEB M0491）中重组蛋白的过表达进行了72。简而言之，将大肠杆菌颗粒重悬于50 mL冰冷的缓冲液A（50 mM Tris pH 7.5，500 mm NaCl）中，并补充了完整蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，11697498001），0.2％Triton X-100（Triton X-100）（Themo X-100）（Hexto X-100）（Hexto Fisherigic and 85％DM，SSS SA）D2650-100ml），在Branson SFX150超声器上进行360个周期（5 s左右）的超声检查。在寒冷室的4°C冰桶上超声处理时，将细菌裂解物保持在搅拌器上搅拌。通过以15,000×g离心15分钟，在4°C下清除细菌裂解物。对于蛋白质纯化，我们使用了äktaAvant 25色谱系统。All 50 ml of the cleared lysate was loaded onto the cOmplete His-Tag purification column (Merck, 6781535001) pre-equilibrated in buffer A. The loaded column was washed with 15 column volumes (CV) of buffer A. Fusion protein was eluted in 10 CV of elution buffer (50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 250 mM imidazole) and diluted 1:1 in存储缓冲液（50 mm Tris pH 7.5，125 mm NaCl，1 mm DTT，5％DMSO，10％甘油）。富含GFP的馏分在他的亲密性纯化后合并，并通过连接到500μl毛细管管连接到平衡的SuperDex 200增加10/300 GL柱的注射阀（Cytiva，28-9909-44）。用0.15 cv的冰冷的SEC缓冲液（50 mm Tris pH 7.5，125 mm NaCl，5％DMSO，1 mm DTT）平衡了加载的柱，并补充了完整的蛋白酶抑制剂。将融合蛋白洗脱成300μl的馏分，并用1.1 cV的冰冷的SEC缓冲液补充了完整的蛋白酶抑制剂。汇集了洗脱部分。使用30 kDa MWCO Amicon Ultra离心滤器（Merck，UFC903024），在4,000×g下以4,000×g离心30分钟，进一步浓缩了脱脂液。在存储缓冲液中将浓缩馏分稀释为1：100，重新配置并在-80°C下储存。

　　对于体外液滴形式实验（图1F），我们使用Nanodrop 2000系统（Thermo Fisher Scientific）测量了纯化的MSFGFP标记的蛋白质的浓度，然后将蛋白稀释至储存缓冲液中所需的浓度（50 mm Tris pH 7.5，125 mm Nacl Nacl，125 mm Nacl，1 mm nacl，1 mmmmmmmmmmmmmmmmmm dm，5％dm，5％DM，5％DM，5％DM，5％DM。如前所述82,83进行体外液滴形成测定法。将蛋白质制剂与2.5μl20％PEG 8000混合在去离子水（w/v）中。将所得的5μl移到了腔室盖玻片上（Ibidi，80826-90）。在幻灯片上的滴度平衡3分钟后，获得图像，其LSM880共聚焦显微镜配备了Plan Apochromat×63/1.40 Na Oil DIC物镜，并带有×1缩放。凝结物形成的定量基于至少在每个条件至少两个独立图像系列中获得的十个图像。

　　使用Zen Blue V.3.4图像分析和Intellisis软件包检测到蛋白质液滴。使用以前训练的智能模型以光谱模式，我们将单个像素的图像分割成对象（液滴区域）或背景（图像背景）。通过将定义为液滴面积的物体中的GFP信号的总和除以视野中的GFP信号的总和来计算冷凝蛋白的相对量。所有值均使用rstudio计算。使用GraphPad Prism9生成图。为了将数据拟合到Sigmoidal曲线，我们应用了内置的非线性回归函数（sigmoidal; x是浓度）（图1G）。

　　对于涉及EGFP – BRD4 :: NUT的实验（图4E），将450,000个HEK293T细胞接种到六孔板上，并第二天用3 µg PRK5-EGFP – BRD4 :: nut质粒使用9 µL PEI PEI Star Trectionge Reagent Reagent Reagent Reagent Reagent（Tocris，tocris，7854）转染。转染后，使用带有柱内DNase消化的RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）从细胞中分离总RNA。使用核糖酶（Roche，KK8562）的KAPA HyperPrep试剂盒制备RNA-Seq库，并在Illumina NovaseQ2系统上以100 bp配对的末端模式进行了测序，每个样品的片段为55-65万片段。

　　使用Trimgalore V.0.6.10（https://doi.org/10.5281/zenodo.7598955）对RAW RNA-SEQ数据进行过滤和修剪。将HEK293K细胞的过滤数据映射到自定义的人基因组HG38，包括使用Star Aligner84克隆到HG38人类基因组的EGFP序列。计数 - 阅读表是通过使用同一程序生成的。使用R（v.4.4）86中的DESEQ2 package85进行差异表达分析。差异表达的基因被定义为具有折叠变化≥1.2，本杰米尼– Hochbergp≤0.01，并且在50个读取的实验样本中，最小平均读数计数。补充表3列出了差异表达的基因。

　　使用PCA使用PCAPLOT函数从归一化读取矩阵上的DESEQ2软件包中进行，该矩阵的deSeq2 package是使用DESEQ2软件包转换的，并使用GGPLOT2绘制（扩展数据图9D）。使用欧几里得距离在R中的DIST函数计算距离矩阵，并用pheatmap在R中可视化（扩展数据图9E）。使用GGPLOT2创建了火山图（图4E和扩展数据图9G）。

　　对于先前研究87的BRD4 :: NUT目标的参考数据，从基因表达综合（GSE233302）下载了原始数据，并如上所述进行处理。定义了差异表达的基因，倍数变化为1.2，调整后的P< 0.01. only BRD::NUT and control samples were used.

　　For experiments involving expression of NUP98::KDM5A and KS variants, total RNA was extracted using the Monarch Total RNA Miniprep Kit. Reverse transcription was performed using the RevertAID RT Kit (Thermo Fisher Scientific) and qPCR was done using the SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) or AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Red Maple Hi-tech Industry Park) on the Bio-Rad CFX-Connect Real-Time PCR Detection System. The results were normalized to GAPDH and analysed using the method (Supplementary Fig. 8e).

　　Cleavable mCherry was included in eGFP–BRD4::NUT and GFP–NUP98::DDX10 expression vectors to better distinguish and compare transfected cells. U2OS cells were seeded on eight-well chamber slides (Ibidi, 80826-90) at density of 30,000 cells per well and transfected the next day with pRK5-mCherry-P2A-T2A-eGFP–BRD4::NUT plasmids using FuGENE HD and 150 ng plasmid per well according to the manufacturer’s instructions. The next day, cells were treated with 5% 1,6-hexanediol (Sigma-Aldrich, 240117) in cell culture medium for 5 or 15 min, fixed with 4% PFA for 10 min, washed and stored in PBS. Nuclei were stained using 0.5 µg ml−1 DAPI in PBS (Invitrogen, D1306).

　　For the eGFP–BRD4::NUT 1,6-hexanediol experiments, images were analysed using ZEN Blue v.3.9 software. Nuclei were segmented using automatic Otsu thresholding and the mean intensity, s.d. and maximum intensities from the GFP and mCherry channels were measured for each nucleus. Nuclei with no expression (mean mCherry intensity < 1.5) abnormally high expression (mCherry expression >40）和具有饱和GFP信号的细胞被排除在外。图像是从三个生物复制实验中获取的，最后将测量值合并并组合成单图（扩展数据图9i）。

　　To analyse 1,6-hexanediol treated GFP–NUP98::DDX10-expressing cells, nuclei were first segmented using Otsu thresholding (click thresholding: 2, 255) and GFP–NUP98::DDX10 foci in nuclei were detected on the basis of the GFP signal (click thresholding: 9, 255).用倒置阈值确定了焦点以外的核背景区域，并且该区域缩小了Erode设置为2。为了可靠地测量核中的弥漫性GFP，GFP采集设置相应地设置了。但是，由于NUP98 :: DDX10灶与核质的GFP强度的对比度很高，因此GFP信号通常在NUP98 :: DDX10 FOCI上饱和，在GFP表达较低的细胞中已经饱和。作为妥协，我们排除了在大于8像素的区域中检测到的饱和灶的所有核。无表达的核，定义为平均麦克里强度< 1.5, and nuclei with very high expression, defined as mCherry expression >40，被排除在外。图像是从两个生物复制实验中获取的。将测量值合并并组合成单图（扩展数据图10i）。由于允许饱和的GFP的小区域，因此未绘制NUP98 :: DDX10样品的平均GFP强度，S.D。GFP强度的值应谨慎解释，而背景GFP被认为是最可靠的。

　　每种实验一式三份进行（补充图8B）。简而言之，将25×103小鼠白血病细胞接种在甲基纤维素（甲基甲基M3434，干细胞技术）中，并对菌落进行评分和重菌（10×103个细胞或5×103个细胞）。

　　为了表征源自NUP98 :: KDM5A菌落形成测定法的细胞，用PBS洗涤细胞，并将其重悬于PBS中，在具有0.5％FCS的PBS中，然后用以下抗体的1：200稀释剂染色30分钟，以下抗体（所有来自Biolegend）（全部来自Biolegend）：Anti-6C BV4C BV421（RBV421）（RBV421）（RBV421）（2B8）。对于门控策略，根据正向散射高度（FSC-H）和侧面散射高度（SSC-H）歧视活细胞。基于正向散射高度（FSC-H）和正向散射区域（FSC-A）进行门控。MCHERRY+细胞通过其在ECD通道中的信号强度鉴定。根据Pacific Blue通道（BV421）的信号强度评估了抗小鼠GR-1/LY-6C的细胞染色，而根据APC通道中的信号强度，评估了抗小鼠套件染色。在BD FACSCANTO II上分析了样品。使用FlowJo（FlowJo）软件包进行数据分析（补充图8C，D）。

　　为了研究KS对增殖的影响，使用GFP – NUP98 :: KDM5A AML细胞进行了基于竞争的增殖测定法，该细胞用强力霉素可诱导的NB – KS构建体以先前所述的25-30％的感染速率进行感染率，如前所述，如前所述56。总共将5×105个细胞在一式三份的24孔板中播种。将强力霉素添加到培养基中，并使用Cytoflex的仪器（Beckman Coulter）测量MCHERRY的荧光表达（用NB – KS构建体表达）一次。通过表达NB-KS构建体（MCHERRY+）的混合群体与未表达NB – KS构建体（MCHERRY-）的细胞（MCHERRY-）的竞争细胞的混合群体（MCHERRY+）的竞争细胞的混合群体（MCHERRY-）来监测NB-KS构建体对细胞适应性的影响。使用FlowJo（FlowJo）软件包进行数据分析，并将值标准化为强力霉素诱导后的第3天（补充图7b，c）。

　　将细胞分选用于麦克利，并在生物学三份中播种，并每48 h或72 h用多西环素处理。使用Intellicyt IQue筛选器（Essen Bioscience，Sartorius Group）定期确定细胞数，并与预报软件（Essen Bioscience;标准版10.0（R1）V.10.0.8272; Build Date，2022年8月25日；图4G）。

　　对于与NUP98 :: KDM5A实验相关的逆转录病毒的产生，使用聚乙二胺（分子分子，25,000 DA，Sigma-Aldrich），将铂-E细胞与20 µg转移载体和5 µg PCMV-GAG/POL共转染。转染后48小时和56小时收集病毒上清液，过滤（0.45 µm），并补充重组MIL-3（10 ng ML-1），MIL-6（10 ng mL-1）（peprotech）和MSCF（100 ng ml-1）。在聚甲烯（4 µg mL -1）（默克化学和生命科学）的情况下，用病毒上清液（1：2稀释）在37°C下在37°C下在37°C下用病毒上清液（1：2稀释）（稀释1：2稀释）（稀释1：2稀释）45分钟（稀释1：2稀释）。对于慢病毒的产生，使用PEI使用4 µg转移载体，2 µg PSPAX2和1 µg pmd2.g转染Lenti-X 293T细胞。转染后48小时和72小时收集慢病毒并过滤（0.45 µm）。添加病毒上清液（1：3稀释）后，将靶细胞旋转，然后在聚甲烯（5 µg mL -1）的情况下在1,000×g下37°C离心90分钟。

　　对于与52K构建体相关的实验，人类腺病毒型C5（AD5）野生型购自ATCC（VR-5），在HEK293细胞上传播，并在-20°C下通过40％甘油在40％的甘油中储存在40％的甘油中，用于感染。AD5Δ52K突变体PM8001（δ52K）88（P.听证的礼物）在表达WT 52K57的转基因细胞系（A549）上传播，并在Infections的-20°C下以40％的甘油含量在40％的甘油中纯化，并储存在40％的甘油中。使用两个顺序的超速离心氯化剖腹梯度纯化病毒。为了实现储存的冷冻保护溶液，如下稀释病毒：在氯化丘中的两个部分病毒，一种5倍5倍病毒稀释溶液（40 mm Tris pH 8，400 mm NaCl，H2O中的0.4％BSA），两个部分100％甘油。如“腺病毒后代生产”部分所述，通过传染性焦点形成测定确定病毒滴度。除非另有说明并在感染后的指定数小时收集，否则使用10种感染的多种感染进行了所有感染。要感染细胞，将病毒在没有FBS的细胞培养基中稀释。在37°C下2小时后，加入含有10％FBS的培养基。对于病毒饲养测定，在2小时后去除病毒感染培养基，然后在添加培养基之前将细胞洗涤一次，然后在PBS中洗涤一次以去除多余的病毒。

　　通过刮擦收集感染的细胞，然后通过四个冻结液在液氮和37°C的水浴中裂解。除非另有说明，否则在感染后48小时收集细胞。通过在4°C下以最大速度离心5分钟，从裂解物中除去细胞碎屑。为了分析病毒产量，将裂解物在补充2％FBS和1％青霉素 - 链霉素的DMEM中串联稀释，并用于感染A549细胞。感染后2小时去除感染培养基，将细胞洗涤一次PBS以去除多余的病毒，并用生长培养基覆盖细胞。在4％多聚甲醛固定之前将细胞孵育24小时，并使用病毒DNA结合蛋白（DBP）的免疫染色作为感染的指标，通过免疫荧光共聚焦显微镜进行分析。对于三个独立重复的每个重复，捕获了三个视野，并确定了DBP阳性细胞的百分比。选择了最接近50％DBP阳性细胞的连续稀释以计算后代产生。总细胞数是通过在等效条件下平行生长的细胞来确定的。将焦点形成单元的数量计算为总细胞数量和抗原阳性细胞百分比的乘积，从而调整了泊松分布。通过在感染后4小时收集感染的细胞，确定传染性单位的数量，并计算出复制的平均值（图5E），确定了病毒输入（图5E）。为了补充Δ52K突变病毒感染，感染细胞，然后在感染后2小时转染。

　　根据瑞士法规（Canton Vaud，许可证号VD-H28），维持斑马鱼和饲养。该研究使用了野生型（TLAB）鱼。受精后立即收集胚胎。在28°C下生长胚胎，并如前所述确定发育阶段。总共将每个RNA的180 pg注射到一个单细胞阶段胚胎的蛋黄中。允许胚胎在28°C孵化器中发育，然后使用镊子手动解剖。将胚胎转移到37°C的安装培养基（0.8％低熔点琼脂糖（含15％（v/v）optiprep（v/v）optiprep（sigma-aldrich，d1156）））中，并安装在Ibidi Glass-Bottom-μ-dish上（Ibidi，Ibidi，81158-400）。

　　使用Nikon SR HP Plan Apo×100/1.35 SIL WD 0.3物镜在尼康旋转盘上成像，在28°C的温度控制室中。4D成像，X，Y，Z和时间是通过保持27 µm的Z-stack和0.3 µm的Z-Stack，其时间分辨率为2分钟。使用ImageJ进一步分析显微镜图像并处理。首先在3D中分割了512细胞阶段的整个核，并使用3D对象计数器插件进行了进一步的分析。.CSV格式中生成的数据帧导出到RSTUDIO软件以绘制和可视化。使用GraphPad Prism进行统计分析。进行了带有邓恩（Dunn）多重比较校正的Kruskal – Wallis测试，以计算不同组之间的重要性。

　　将培养的细胞在PBS中两次洗涤，并在RIPA缓冲液中在轨道振动筛上4°C中裂解30分钟。随后，将细胞裂解液以20,000×g离心10分钟。清除的裂解物被转移到新的管子上，并使用BCA测定法（Thermo Fisher Scientific）进行定量。然后，将20μg提取的蛋白质补充硫酸锂（LDS）载荷缓冲液（Thermo Fisher Scientific，NP0007），补充了50 mM DTT，并在98°C煮沸5分钟。然后将样品在4–12％的Nupage SDS凝胶（Thermo Fisher Scientific，NP0322Box）上运行，并使用IBLOT2 DRY GEL传输设备（Invitrogen）转移到聚乙烯二烯氟化物膜（Thermo Fisher Scientific，IB24002X3）上。用5％脱脂牛奶在TBST中封闭膜1小时，然后与在2％牛奶中稀释的一抗和TBST孵育，在4°C下过夜。这项研究中使用的主要抗体包括TCOF1（SANTA CRUZ，SC-374536，1：750），GFP（Invitrogen，A11122，1：2,000），NPM1（Invitrogen，32-5200，1：2,000），HP1α（CST，2616，22616，1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：ABC，GAPDH（CST，14C10，1：4,000）和HSP90（BD，610419，1：2,000）。在1：1,000稀释下，使用了与宿主物种的HRP偶联的二抗。用HRP底物Supersignal West Dura（Thermo Fisher Scientific）可视化蛋白质，并使用Bio-Rad Universal Hood III和Image Lab 6.1软件检测到（补充图13）。

　　使用标准方法进行SDS -PAGE和免疫印迹分析。简而言之，使用LDS载荷缓冲液（Thermo Fisher Scientific，NP0007）制备蛋白质样品，并补充了25 mm DTT，并在95°C煮沸10分钟。通过SDS -PAGE分离等量的蛋白质裂解物。将蛋白质转移到甲醇激活的聚偏氟化物膜（Millipore-Sigma，IPFL00010）30 V时，持续60-120分钟，并在阻塞缓冲液中阻塞（在TBST中补充了0.05％硫唑此），在房间温度下1 h。将膜在4°C下与在阻塞缓冲液中稀释的原代抗体一起孵育过夜，在TBST中洗涤30分钟，在室温下用HRP偶联的二抗在阻止缓冲液中稀释并再次在TBST中洗涤30分钟。

　　The following primary antibodies were used: anti-adenovirus type 5 antibody (raised against whole adenovirus capsids; recognizing late proteins Hexon, Penton, Fiber (Abcam, ab6982); rabbit, polyclonal, western blot, 1:10,000), antibody to 52K (gift from P. Hearing80, rabbit, polyclonal, western blot, 1:10,000), IIIa（摘自P. Enager91，兔子，多克隆，Western印迹，1：10,000），DBP（来自A. Levine81的礼物，鼠标，B6-8，Western Blot，1：1,000）和GAPDH（Genetex，GTX100118，43712，43712，Rabbit，rabbit，polyclonal，polyclonal，western blot，1：1：1：5,000）。为了进行免疫印迹分析，使用的是辣根 - 过氧酶偶联的山羊抗兔二抗（Jackson Laboratories，111-035-045），浓度为1：10,000。

　　使用Pierce ECL Western印迹底物（Thermo Fisher Scientific，34577）对蛋白质进行可视化，并使用Syngene G-Box使用Genesys获取软件检测到蛋白质。在Adobe Illustrator CS6中处理并组装图像（图5F和补充图11F和14）。

　　通过独立重复实验证实了所有实验观察结果。在数据捕获或分析过程中未使用盲或样品随机化。数据分析中没有排除数据。没有进行统计检验以预先确定样本量。除非另有说明，否则显示了数值数据的平均值，其中误差线代表S.D.样本。使用GraphPad Prism V.9和Rstudio V.2024.04.2和MulticOmp软件包进行统计。所有t检验都是双面的。在确定统计检验时假定正态分布。除了Tukey的多重比较测试外，没有假定相等的差异。精确的P值如下：图1E：FRAP图，P≤0.0001（ΔKillSwitch），P≤0.0001（F-TO-E＆D），P≤0.0001（F-TO-TO-A）（F-TO-TO-A），P≤0.0001（F-TO-G-G）（F-TO-G）（F-TO-G），P≤0.0001（0f），P≤0.0001（0f），P≤0.0001（P≤0.0001（F12A），P12A（F12A），P12A，P = 0.02（p12a），p = =10。（ΔKS-3F），p≤0.0001（11G3F3G），p≥0.9999（C16至A），P = 0.57（M-TO-E＆D）；GFP强度图，p = 0.97（ΔkillSwitch），p = 0.56（f-to-e＆d），p = 0.68（f-to-to-a），p = 0.53（f-to-t-to-g），p = 0.27（0f），p = 0.13（f12a），p = 0.28（f13a），p = 0.28（f13a），p = 0.95（p = 0.95）（11G3F3G），p = 0.9999（C16至A），P = 0.71（M-TO-E＆D）。图2F：NPM1图，p = 0.02（nb），p = 0.16（ks），p = 0.29（ksf-to-a），p = 0.01（2×ks）;TCOF1图，p = 0.99（nb），p = 0.41（ks），p = 0.18（ksf-to-a），p = 0.19（2×ks）;SRRM2图，p = 0.92（nb），p = 0.39（ks），p≤0.0001（2×ks），p = 0.9998（2×ksf-to-to-g）;HP1α图，p = 0.85（nb），p = 0.99（ks），p = 0.99（2×ks），p = 0.76（2×ksf-to-to-g）。

　　使用默认参数使用AlphaFold（v.3）33预测Alphafold模型。用Chimerax（V.1.6）92可视化模型。使用自定义脚本生成联系图。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。