P-BAC SARS-COV-2携带分离物Wuhan-Hu-1（WT-SARS-COV-2 BAC）的序列的p-bac-cov-2是根据先前描述的方法44构建的。WUHAN-HU-1和2019N-COV/USA-WA1/2019菌株之间的唯一区别是ORF8和2个无声改变（ORF1A和ORF1B）中的一种氨基酸变化。将两个无声改变引入了BAC克隆中，以使与野生型SARS-COV-2（A20085G和G26840C）分化。如先前所述，使用lambda红色重组系统与I-SCEI归核酸内切酶产生了尖峰（N501Y-SARS-COV-2 BAC）中N501Y取代的P-BAC SARS-COV-2，如前所述。为了生成N501Y-SARS-COV-2 BAC，与N501Y改变的重叠SARS-COV-2尖峰序列的前向和反向引物合成了靶质粒（PEP-kans），然后合成了序列（Invitrogen）。带有SARS-COV-2序列的重叠末端的PCR片段，用使用Pep-Kans作为模板进行了描述的引物，将Kanamycin抗性标记物进行了放大。使用凝胶纯化试剂盒（Invitrogen）纯化PCR片段。将纯化的PCR片段电穿孔到携带P-BAC SARS-COV-2的大肠杆菌的GS1783菌株中。选择成功的重组剂具有卡那霉素耐药性。通过阿拉伯糖诱导I-SCEI裂解，随后是重叠末端的同源重组，可以去除卡纳米霉素标记。通过复制板选择成功的重组剂，以损失卡纳霉素耐药性。纯化重组者并测序以确认将蚀变引入BAC克隆。用于引入N501Y更改的引物序列如下：向前，5'-CCTTGTAATGGTGTGTTGTTGTTTATTAATTTATTATTACTTACTTCTTCTTCTTTACAATCATATAT

　　GGTTTCCACCCACTTATGTGTGTGTGTGTGTGAGGACGACGATAAGTAG-3';反向，5'-catgtagaagttcaaaaagaaagaagtactactctctgtatgtggtggtggtaaccaa ca

　　CCATTAGTGGGTGGAAACCATCAACCAATTAACCAATTCTCTGATTAG-3'。对于SARS2-N501YMA30的产生，在单轮重组中引入了四个取代（E484K，Q493R，Q498R和N501Y）（4S），然后在S蛋白中进行K417m取代，然后在S蛋白中取代NSP4（T295I）的取代（T295I）取代（T295I）的序列（T295I）的序列（T295I）的序列（T295I）的序列（TRS）。（A26058G）。如下一节所述，使用CRISPR – CAS9编辑引入了NSP8（S76F）和NSP9（T67A）的变化。用于4S更改的引物序列如下：正向，5'-CGGTAGCACCTTGTAATGGTGTGTTAAAGGTTTTATTATTATTATTACTTACTTCTTTCCTTATA

　　cgatcatatggtttttccgacccacttatgaggatgacgacgataagtag-3';相反，5'- gtatggtggtggtaaccaaccataagtgggtggtcggaaaccatatgatcgtaaa

　　GGAAAGTAACAATTAAAACCTTTCAACCAATTAACCAATTCTGATTAG-3'。用于K417M更改的引物序列如下：正向，5'-GaggtgatgaAgtCagacaAatcgctcccccaggggagggagggaggaggaggaggaaactggaatgatgctgct

　　gattaattataaaaaaggatgacgataagtag-3';相反，5'-cagcctgtaaaaatcatctggtattaattataataataataataataatcagcaatcattcatca

　　GTTTGCCCTGGCGATCAACCAATCAATTAACCAATTCTGATTAG-3'。用于NSP 4变化的引物序列如下：前进，5'-GACATATATCAGCATCTAGTAGCTGGTGGTGGTGGTGGTGTGTAGTAGTAGTATCGTAGTAGTA

　　atatgccttgcctactattttttatgagagagagagagaCgataAgtag-3';反向，5'- caccaaaagctttcttctaaAcctcataaaaaaaAtaggcaaggcatattact

　　Acgatagctacaatacccaaccaatcaatcaatccaattctgattgatag-3'。用于M蛋白的TRS改变的引物序列如下：正向，5'-CTGGTCTAAACGAACACTAAATATATATATATATATATATATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAA

　　ttttttagccatggcagaaggatgacgacgataagtag-3';反向，5'- caacggtaatagtaccgtgtggaatctgccatgcatgctaaaattaaagct

　　CCAAACAGAAAACATAATAATAATAATAACCAATTAACCAATTCTGATTAG-3'。基本变化以斜体形式显示；与堪萨斯州PEP-kans互补的序列以粗体显示。

　　接下来，使用CRISPR-CAS技术引入了SARS2-N501YMA30的NSP8（S76F）和NSP9（T67A）变化，以生成具有完整的SARS2-N501MA30改变的BAC cDNA克隆。通过两步pcr链接了改变的编码PCR产物，并从具有NSP8或NSP9改变的两个PCR片段进行了扩增。使用在线资源（https://chopchop.cbu.uib.no）设计了针对所需裂解站点的指南RNA。用Engen SGRNA模板寡核苷酸设计器（NEB; https：//sgrna.neb.com/#！/sgrna）生成DNA寡核苷酸序列，以包括指导RNA转录的基本元素和Cas9识别的RNA支架。根据制造商的方案将DNA寡核苷酸化学合成并用Engen Sgrna合成试剂盒（NEB）转录。使用君主套件进行RNA清理（NEB）纯化SGRNA。CRISPR – CAS9裂解是根据制造商协议（NEB）进行的。使用Purelink快速凝胶提取和PCR纯化组合试剂盒（Invitrogen）通过凝胶纯化回收切割的BAC产物。根据制造商的协议，将纯化的BAC产物与改变的PCR产物一起与Gibson组装（NEB）进行体外重组。连接产物转化为DH10β细胞。培养从连接产物衍生的细菌菌落进行DNA提取以分离突变体BAC。通过Sanger测序验证了变化的引入。SGRNA的寡核苷酸序列如下：SGRNA1，5'- TTCTAATACGACTCACTATAGTAGTAGATATATATATATATATATATATATATATATCACAGTTTTTTTAGA

　　GCTAGA-3';sgrna2，5'-ttctaatacgactcactatagtctgtaacaaacctacaagggtttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt

　　Agagctaga-3'。靶DNA序列被强调。扩增编码NSP8改变的PCR产物的引物序列如下：正向，5'-AcaggagtttagatatataTaTaTaTaTaTaTaTaTaTaTaTcaCagggaC-3';反向，5'-GTCCTCAAATCTAGCCTGTTTA-3'。用于扩增编码NSP9改变的PCR产物的引物序列如下：正向，5'-TaaaAcaggctagattTgaggAC-3';相反，5'-GTGTGTCTGTAACAAACCTACAAGGTGGTGGTTCCAGTTCTGCATAGATAGAT-3'。基本变化以粗体表示。

　　根据制造商的方案，将2μg的突变体BAC转染到6孔板中的Lipofectamine 3000（Invitrogen）中转染到VERO E6细胞（ATCC）中。每天监测细胞的细胞质效应（CPE）。当CPE在-80°C下冻结> 50％时，收集培养物。RSARS2-N501YP0和RSARS2-N501YMA30在补充20％胎牛血清（FBS）的DMEM的Calu-3细胞中进一步传递。病毒滴度通过牙菌斑测定确定。

　　BALB/C和C57BL/6小鼠为6-10周或6个月大，从Charles River Laboratories获得。在黑暗/光周期，环境温度和湿度的标准条件下，在爱荷华大学的动物护理部门保持小鼠。将小鼠随机分配给不同的组，每组数量足以获得统计显着性。2019-NCOV/USA-WA1/2020（登录号MN985325.1）和20H/501Y.V2（B.1.351，BEI目录编号NR-54009）从BEI中获得，并在Calu-3 2B4细胞中被传递。Calu-3 2B4细胞在Dulbecco的修改后的Eagle培养基（DMEM，Gibco）中生长，并补充了20％FBS。Vero E6细胞（ATCC CRL-1586）在补充10％FBS的DMEM中生长。所有病毒在传播后进行了测序，并发现与输入应变匹配。

　　RSARS2-N501YP0通过小鼠肺的串行盲道通过在8-10周龄的BALB/C小鼠中进行。简而言之，在每个传递时，将两只小鼠用鼻内的50μl病毒接种。在2/3 DPI时，将小鼠安乐死，并在PBS中合并肺，并用于感染天真小鼠。经过30次通过后，获得了病毒，并使用Vero E6细胞纯化了牙菌斑3次。获得了几种分离株，并选择了一个分离株进行进一步研究（SARS2-N501MA30）。SARS2-N501YMA30在Calu-3 2B4细胞中进一步传播。

　　用氯胺酮 - 氧基嗪麻醉小鼠，并用指示的病毒量为50μLDMEM，并在鼻内感染小鼠。每天监测动物体重和健康。所有SARS-COV-2的实验均在爱荷华大学的生物安全3（BSL3）实验室中进行。所有动物研究均获得爱荷华大学动物护理和使用委员会的批准，并符合《实验动物护理和使用指南》的规定。

　　在指定的时间，小鼠被安乐死，并用PBS对经心脏灌注。在通过离心和滴定澄清之前收集和匀浆器官。在DMEM中连续稀释病毒或组织匀浆上清液。将Veroe6细胞的十二孔板在37°C的5％CO2中接种1小时，并每15分钟轻轻摇动。去除接种物后，用含有2％FBS的0.6％琼脂糖覆盖板。3天后，去除覆盖物，并用0.1％的晶体紫色染色可视化斑块。病毒滴度被定量为每ML组织的PFU。

　　通过腹膜内注射氯胺酮 - 氧基噻嗪来麻醉小鼠。血液是通过毛细管（Fisher Scientific）的恢复轨道出血收集的。使血液在室温下凝结30分钟。通过离心阐明血清，并转移到新管以-80°C下储存。为了收集全血，使用了肝素化的毛细管（Fisher Scientific）。

　　通过腹膜内注射氯胺酮 - 氧基噻嗪并用PBS灌注小鼠。组织固定在福尔马林锌中。对于常规的组织学，将组织切片（每个约4 µm）用H＆E染色。使用基于分布的序数评分：0，无；1， <25%; 2, 26–50%; 3, 51–75%; 4, >75％的组织场。通过基于严重性的序数评分评估血管周淋巴炎症：0，不存在；1，次要（单独到松散的细胞浸润）；2，中等（中小型聚集体）；3，严重的（稳健的聚集体周围周围是圆周的骨料，可以延伸到相邻的实质中）。使用修饰的H得分评估间质疾病的H：0，无；1，次要（隔膜中的细胞增加）；2，中度（细胞浸润，有一些增厚的隔sa，而罕见的炎性细胞延伸到管腔中）；3，严重的（在增厚的隔膜中的细胞浸润，并充满肺不张症和/或弥漫性肺泡损伤的证据（水肿或透明质酸膜））。对于每个分数，将其乘以受影响的肺部百分比，然后对每个肺部求和100分，以获得0-3的最终得分。对于SARS-COV-2抗原检测，将载玻片与阻塞试剂（10％正常山羊血清30分钟）一起孵育，然后用兔单克隆抗体抗SARS-COV-2 N蛋白（1：20,000稀释60分钟，数量40143-R019，Sino Biological），然后与Rabbition（Diaako）孵化（Diaako）（Diako）（Diako）。使用Masking46的研究后方法，通过熟悉该模型的登机兽医病理学家评估肺组织切片。IHC在组织中染色的百分比分布（0，不存在；1，0–25％；2，26–50％；3，51–75％；4，> 75％的组织。

　　将动物用氯胺酮 - 二甲苯和灌注10 mL PBS灌注。在HBSS缓冲液中除去，切碎并消化肺部，该缓冲液由2％胎牛血清，25 mM HEPES，1 mg ML -1胶原酶D（Roche）和0.1 mg ML -1 DNase（Roche）在37°C下37°C持续30分钟。单细胞悬浮液通过通过70μm细胞过滤器的通过来制备。用权杖2.0细胞计数器（Milliporesigma）枚举细胞。用ACK裂解缓冲液处理全血1分钟。清洗细胞并沉淀。然后用1μg抗CD16/抗CD32（2.4G2）在4°C下洗涤细胞，并在4°C下用以下抗体在4°C下染色30分钟：V450抗小鼠CD45（克隆30-F11; Catalog Number 560501）;APC抗小鼠CD220（克隆RA3-6B2，目录编号553092）;APC/Cyanine 7抗小鼠CD3E（克隆145-2C11，目录编号100330）;APC/Cyanine 7抗小鼠CD11C（克隆HL3;目录编号561241）;FITC抗小鼠LY6G（克隆1A8;目录编号127606）;PE抗小鼠CD11b（克隆M1/70;目录编号101208）;PE/Cyanine 7抗小鼠CD8（克隆53-6.7;目录号100722）;PERCP/CYANINE 5.5抗小鼠CD4（克隆RM4.5；目录编号550954）;FITC抗小鼠LY6G（1A8;目录编号127606）;PERCP/CYANINE 5.5抗小鼠LY6C（克隆HK1.4;目录编号128012）;CD64（克隆X54-5/7.1;目录编号139304）。所有抗体在1：200稀释时使用。洗涤细胞，固定并用细胞膜/细胞处理（BD Biosciences）透化。门控策略在补充图1中显示。

　　对于细胞内细胞因子染色（IC），在有2μM肽池和Brefeldin A（BD Biosciences）的情况下，在37°C的96孔菜肴中培养淋巴细胞5-6小时。然后将细胞标记为细胞表面标记物，用细胞膜/细胞处理溶液（BD Biosciences）固定/透化，并用抗IFNγ和抗TNF标记（1：100稀释）。所有流式细胞仪数据均使用BD FACSVerse获取，并使用FlowJo软件进行分析。

　　根据制造商的协议，使用Trizol（Invitrogen）或Direct-Zol RNA Miniprep Kit（Zymo Research）从组织中提取总RNA。DNase处理后，使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems），将200 ng的总RNA用作第一链cDNA的模板。使用Power Sybr Green PCR Master Mix（Applied Biosystems），通过实时定量PCR（Applied Biosystems）对所得的cDNA进行分化。使用每个基因的重复物中的平均值来计算标准化为HPRT的转录本的相对丰度，并以2 -ΔCT表示。以前报道了用于细胞因子和趋化因子的底漆47。为了检测病毒基因组，使用以下引物来扩增N蛋白的基因组RNA：2019-NCOV_N1-F：5'-GACCCCAAAAATCAGCGAAAT-3';2019-NCOV_N1-R：5'-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3'。以下引物用于扩增E蛋白的亚基因组RNA：f，5'-cgatctcttgtgtagatctgttctc-3';R，5'-atattgcagcagtacgcacacaca-3'。

　　用TRIZOL试剂处理样品，以进行病毒灭活和RNA提取。使用Artic Network（https://doi.org/10.17504/protocols.io.bdp7i5rn）的测序协议（V2）和引物池（V3）制备测序库。在牛津纳米孔技术的奴才序列中对读取进行了测序，并使用MEDAKA在ARTIC Network NCOV-2019 BioInformatics协议v1.1.0（https://artic.network/nc.network/ncov-2019/ncov-2019/ncov-2019/ncov201919-bioinformatics-sop）中使用Medaka进行了共识序列。每个样品总共获得了249,944个平均读数±82,509（标准偏差）。质量过滤和对齐后，每个样品的平均测序深度> 200×。小鼠肺匀浆中P10和P20病毒的共识序列包含具有低测序深度的区域。为了准确覆盖这些间隙，我们使用单个PCR反应放大了缺失区域，并在扩增子上进行了Sanger测序。

　　使用Yasara生成了MACE2（NP_001123985.1）的同源模型（NP_001123985.1），并将其停靠在复合HACE2和SPIKE RBD（PDB：6M0J）的晶体结构中。通过首先使用蛋白质制备向导，然后再使用残基扫描模块，对生物氨酸酯（Schrodinger释放2020-4）的MACE2-Spike复合物进行了变化计算。对亲和力进行了优化的稳定性和亲和力计算，并以5Å截止量使用骨干最小化。在Pymol中产生了数字。使用的软件是由SBGRID安装和配置的（参考文献48）。

　　雄性和雌性7-8个月大的C57BL/6小鼠被SARS2-N501YMA30（5,000 PFU）感染。对于吲哚美辛治疗，每天从0-4天或2-6天使用0.2 ml PBS或10 mg kg -1吲哚美辛在0.2 mL PBS中进行治疗。对于肥胖治疗，每天用0.2 mL媒介物（0.5％羧甲基纤维素钠（NACMC），Sigma）或30 mg kg -1降低（生物学）处理小鼠。对于Fevipiprant治疗，将小鼠用5 mg -kg -1 Fevipiprant（Medkoo）每天两次稀释的5 mg fevipiprant（Medkoo）处理。药物和媒介物/PBS是通过口服口服给药的。

　　人类外周血细胞是从爱荷华大学Degowin血液中心的匿名供体获得的。同意书已获得爱荷华大学机构审查委员会的批准。为了获得单核细胞，通过ficoll-Paque和密度梯度培养基（细胞tiva）通过密度梯度离心分离外周血单核细胞（Cytiva），并在RP-10培养基中的1×106细胞ML-1的播种密度（RPMI-1640培养基（RPMI-1640培养基（Invitrogen））中（Invitrogen）补充10％FBS（AT）2 ML-1（rp-10）。- 谷氨酰胺和100 ng mL-1粒细胞巨噬细胞刺激因子（peprotech）+50 ng ml-1 IL-4（peprotech）在37°C下96 h。然后用汉克斯平衡的盐溶液洗涤板，缺少二价阳离子（Invitrogen）去除非粘附细胞。然后将粘附的细胞胰蛋白酶胰蛋白酶固定，并培养10天。

　　通过分析和学生的t检验分析组之间平均值的差异，并使用Microsoft Excel和GraphPad Prism 8通过对数秩（Mantel-Cox）测试分析生存率差异。所有结果均表示为平均值±S.E..M.并经过多次比较进行了纠正。p <0.05被认为具有统计学意义。

　　图2中的数据。除图3K中的两个独立实验中，从两个独立的实验中汇总了1、2D，F和3，该实验显示了来自两个独立实验的代表性数据。图3C中的数据代表了两个独立实验，结果相似。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。