要求提供其他信息和试剂的请求应介绍主要作者（C.R.）。本文生成的所有数据都可以根据要求共享。

　　在25°C或30°C的RNAi实验中饲养苍蝇，在12小时的光明周期中，标准玉米面agar食品上的湿度为40–50％。广州S（CS）菌株用作野生型。在出现后6小时内将苍蝇在二氧化碳麻醉下进行分类，并在同性20组中安装，除了在行为实验中要测试的雄性，这些雄性以每个小瓶的4为4。使用HS-HID条件赋与转基因线收集了用于行为实验的处女女性。L3幼虫在37°C下热震1.5 h。补充表3中概述了使用的其他菌株及其来源61,62,63,64,65,66,67,68,69。

　　跨视网膜（R2500-100mg，CAS号：116-31-4，Sigma-Aldrich）存储在–20°C，作为在乙醇中稀释并用箔纸包裹的50 mm储备溶液。为了将视网膜均匀地融合到食物中，除了图3E中，直接将60μl的储备溶液直接吸入了6毫升液体玉米面酵母食品中，除了图3E中，没有将Ovabg Flies暴露于补充透视因子的食物中。

　　使用带有红外过滤器的Mako U-130B相机（BP735-40.5，MIDOPT）以每秒27帧的速度记录实验。视觉威胁是通过反复通过13 cm×6 cm×2 cm 3d打印的不透明长方形桨（455 nm）而产生的。这以定期间隔为0.3 Hz创建了一个高架阴影，持续30 s。将桨板设置在求爱室（20毫米，5毫米）上方的5厘米处，在由定制的Arduino代码控制的伺服电机上以90o角度设置为90O角，该伺服电机控制着桨的运动参数（频率设置为0.3 Hz，并设置为9）。机械威胁是使用Sony XP500-X扬声器产生的，演奏大声的3-Hz双耳节拍（https://www.youtube.com/watch?v=y-urmcrs61i&t=713S）会导致表面振动。求爱室使用红外背光从底部照亮。

　　行为测定在25°C下在09:00至13:00之间的连续蓝光下进行。经过测试的男性为5-7天，在实验前1天转移到新鲜食品小瓶中。对于用于光遗传学测定的雄性，将苍蝇转移到实验前3天富含透视的食物中。包含视网膜的小瓶用箔纸包裹。在实验过程中，对处女的女性被斩首并最多3小时，以保留化学签名和运动反射。

　　动作选择测定法提出了一个天真的男性，加上一名斩首的HS-HID处女女性，在继续向女性开庭或以应对威胁的方式中打断仪式之间的选择。威胁是在始终如一的7 s（早期），2分钟（中间）或4分钟（晚期）的一致求爱后施加的。只有在审判的前5分钟开始就开始法庭的男性，直到分析中考虑了威胁。使用行为分析软件Boris70手动分析所有测定法，并量化以下参数以衡量威胁对男性求爱行为的影响。

　　求爱指数的定义是在威胁交付的总时间（30 s）的时间（秒内）的时间百分比（以秒为单位）。我们认为，男性通过证明全翼扩展和对女性至少7 s的持续求爱行为来发起求爱。我们将求爱视为表现出刻板印象的求爱活动，包括与男性前肢敲打女性，唱歌（翅膀延伸和振动），舔（雄性长鼻的延伸），以及男性在男性弯曲腹部朝向女性并试图安装她的尝试。有关这些行为的示意性表示，请参见图1a。

　　防御指数是由在威胁交付的总时间内（30 s）表现出防御行为（即逃脱和冻结）的时间（即逃脱和冻结）的时间的百分比（以秒为单位的）定义。

　　作为对照，根据相同的标准在同一时间内没有视觉威胁的情况下评估了行为。

　　在透明的圆形腔室中测试了苍蝇（求爱20毫米，H = 5 mm；运动测定法，h = 3 mm），并在缺乏威胁的情况下从下面照亮的是660 nm（红色）或515 nm（红色）或515 nm（红色）或515 nm（绿色）光。有关与每个图相对应的光遗传学实验条件，请参阅补充表4。在第一个威胁通过之前，灯打开了1秒钟。

　　将单个苍蝇引入一个圆形腔室（24毫米，h = 3毫米）中，并剩下3分钟。适应周期后，苍蝇受到威胁（9个周期和频率为0.3 Hz）。使用Ethovision XT17软件评估了苍蝇的步行速度（以大于4 mm s -1的值为“步行”的阈值被视为“行走”）。步行速度的变化是通过在威胁交付前的30 s平均值后减去30 s的平均步行速度来计算的。

　　束缚的雄性苍蝇（3-6天大）的头胶囊在无糖HL3样盐水填充的成像室中剖析（有关苍蝇解剖的详细信息，请参见参考文献71）。然后将苍蝇放在多光子显微镜下（FEMTO-2D通过Femtonics），并在不同的神经元集中表达钙指示剂GCAMP或GRABDA（有关基因型的详细信息，请参见补充表3）。荧光是由以920 nm（Chameleon Ultra II，相干）为中心的Ti-Sapphire激光器产生的。用MESC v3.5软件（FEMTONICS）控制的，以0.3×0.3μm的像素大小为0.3×0.3μm的图像。使用MESC软件（FEMTONICS），使用共振扫描头以30 Hz的速度以30 Hz的速度拍摄快速记录。使用NOSA软件v1.1.16（神经光信号分析）进行了分析72和自定义的R脚本或GraphPad Prism，感兴趣的区域（ROIS）被手动绘制以进行分析。数据被转换为TIFF文件，并使用Savitzky -Golay滤波器进行处理，或者在脑运动强时移动平均值为2 s（图4C和5B）。任何基线/光漂白校正都没有应用于任何成像数据。最后的时间分辨率为6 fps（Femtonics显微镜数据）或2 fps（尼康显微镜的光遗传学数据）。将平均强度值计算为ΔF/F0（以％），而F0定义为基线活性的平均F（图1H，I，I，2i，2i，J，M，M，N，4E和5C，D，H，K，K，L和扩展数据图3J，4H，4H，7B，E；6F – I，K，L和7A；

　　威胁如前所述（请参阅“威胁设置”部分）。将桨和光源放置在显微镜下方，并倾斜朝向腔室，以使传球的阴影伸向束缚的苍蝇的眼睛。LC16轴突和PMPD神经元中的钙信号在威胁暴露后立即记录30 s，并在威胁暴露后立即记录60 s（图1H，i和5c，i和5c，i和5c，d，h，k，l：在图4F之前和前10 s；当LC16神经元对激光发作反应时，每个记录的前2 s被排除在分析之外。显微镜下的条件设置为20°C以上，湿度为40％。

　　通过开放式头囊直接将100 µL的5-羟色胺（H9523，Sigma-Aldrich）或多巴胺（H8502，Sigma-Aldrich）稀释到无糖HL3溶液中。最终浓度为5-羟色胺，多巴胺为500 µm。在施用前50 s和100 s记录钙信号（申请前的前30 s和最后30 s后施加后进行定量）。

　　为了检查求爱的进展，使用了5-8天大的处女蝇。如前所述，将苍蝇束缚并解剖，使腿和长鼻自由移动（或根据每个图指示的实验固定）。请注意，雄性在成像室上的固定位置不允许翼扩展。在显微镜下的前5分钟内没有停止移动10 s的搅动男性被丢弃。录制启动后，立即将一名斩首的3-5天大的处女雌性束缚在由微观手控制器控制的可移动手臂上，将其腹部朝向雄性苍蝇的头部。在与雌性接触后，记录了钙或Grabda信号的总持续时间为4分钟，而使用摄像机（Thorlabs C1285R12M和SM1D12D Iris Diaphragm）同时观察了飞行行为，以7 fps的记录。前20 s和最后20 s用于定量（扩展数据图6G：1-20 s，240–260 s和400–420 s）。逐帧手动分析腹部弯曲。由于束缚苍蝇显示出典型的行为，其中包括来回移动腹部，只有持续超过1 s或6帧的腹部弯曲事件（腹部下方的腹部弯曲）被视为求爱行为的一部分。

　　使用Nikon A1R+多光子显微镜与Galvo扫描仪以2 Hz的速度进行实验。我们使用了显微镜的两光子1,040 nm红色激光器来激活Cschrimson，同时记录ROI内的钙活性（请参阅主文本图传说中的条件和补充表4的详细信息）。为了激活OVABG神经元，使用具有前面提到的相同成像参数的FEMTONICS显微镜进行了实验。将590 nm的LED放在下方和朝着束缚的苍蝇的位置，用于同时记录Cschrimson（1-S LED和1-S LED-LED间隔的15或7个重复），同时记录。为了在威胁传递期间激活PPM1/2神经元，使用了15次重复的红光重复，重叠了显微镜下30 s的威胁暴露。为了清楚起见，除去LED刺激工件。随着采集的连续进行，图中显示的后序列显示LED停止后立即显示荧光强度（图4D）。

　　使用Nikon A1R+多光子显微镜如先前所述进行苍蝇制备和成像。加入30个单位的木瓜蛋白酶（Roche），将无糖HL3样生理盐水添加到头囊上10分钟以消化大脑的神经胶鞘并促进去除。通过微孔（用于注射的盐水含有CACL2或MGCL2），对果蝇进行局部多巴胺（在盐水中稀释的10毫米）或盐水注射（盐水稀释）。注射溶液用得克萨斯州红色（由Thermo Fisher Scientific，Dextran，10,000 MW）标记，以可视化移液器和注射的定位。根据实验和平均进行多次注射（2-5）次，导致每个实验的平均痕迹。使用斐济（ImageJ）提取荧光轨迹。ΔF/F计算的F0是注射前10帧的平均基线荧光。平均ΔF/f0％的计算窗口为10 s前，最后10 s。ROI被手动选择。

　　在冰冷的PBS中剖析了三到五天的雄性苍蝇大脑，并在室温下固定在4％多聚甲醛溶液中20分钟。然后将固定的大脑在PBST中洗涤四次（0.5％），持续30分钟，并用正常的山羊血清（5％）阻塞30-60分钟。然后将大脑与原代抗体（抗GFP鸡肉，1：1,000或1：2,000、13970，ABCAM；抗Dsred Rabbit，1：250、632496，Takara;和NC82抗BRP，1：50，DSHB）一起孵育2-3天。在PBST中洗涤四个20分钟后，将大脑与二级抗体（Alexa Fluor 488山羊抗Chicken IgG，1：1,000（A28175）或1：2,000（A32931），Thermo Fisher Scientific）一起孵育过夜（Alexa Fluor 488山羊抗Chicken IgG）；Alexa Fluor 546山羊反小鼠，1：2000，A11018，Thermo Fisher；和Alexa Fluor 546山羊抗兔，1：2,000，A11071，Thermo Fisher）。在PBST中进行了四个20分钟后，将大脑安装在Vectashield上的载玻片上，然后用Leica SP8共聚焦显微镜，Nikon A1共聚焦显微镜或带有Airyscan2模块的Zeiss LSM900扫描。

　　在室温PBS中剖析了三到七天的雄性苍蝇大脑，并在室温下固定在4％多聚甲醛溶液中20分钟。然后将固定的大脑在PBST中洗涤（0.3％），每次3次，并用正常的山羊血清（5％）封闭30分钟。然后将大脑与抗BRP（NC82，1：50，DSHB）一起在4°C下用5％山羊血清孵育2天。未使用抗GFP抗体。在PBST中进行了三个20分钟的洗涤后，将大脑与Alexa Fluor 546山羊抗小鼠（1：2,000，A11018，Thermo Fisher）在4°C下孵育2天。在PBST中进行了四个20分钟的洗涤后，将大脑安装在Vectashield上的载玻片上，然后用Nikon A1共聚焦显微镜扫描。

　　使用ImageJ量化了重构的拆分GFP信号。GFP信号被视为LC16轴突末端和细胞体周围的手动绘制体积（多个Z链）中的平均像素强度（徒手射ROI）。从GFP信号中减去了背景荧光（从LC16神经元以外的近端大脑区域的ROI）。统计显着性通过T GraphPad Prism 9中的t检验和双向方差分析评估。

　　我们使用Neuprint（Hemibrain v1.2.1数据集）39平台搜索候选神经元和随后的连接性（https://neuprint.janelia.org/）。

　　有关统计信息的详细信息，请参见补充表1和2。所有统计测试均使用R V2023.03.1+446或GraphPad Prism 9进行。每个行为实验至少在至少3天内重复3次。个人仅测试一次。行为实验的样本量始终代表生物独立的动物。行为索引和钙成像定量显示为框图。盒子分别代表下部（第25）和上部（第75）个四分位数，水平线代表中位数。图上的每个点代表一个苍蝇。求爱的进展行为数据和运动数据不遵循正态分布，因此，非参数Mann-Whitney或Kruskal-Wallis测试，然后进行了康诺夫 - IMAN多个多方向比较后的康诺夫 - IMAN多个成对比较，用于原始数据（p = 0.05，具有Bonferroni校正的P = 0.05）。为了测试遗传操作与处理之间的相互作用，我们应用了双向方差分析。在p <0.05的水平下，不同的字母表示显着差异。我们使用一个样本Wilcoxon签名级测试（μ= 0）来评估扩展数据中的速度变化（∆）是否显着偏离0。我们使用p <0.05的星号使用星号表示了显着性。

　　随着时间的推移，钙成像轨迹表示为S.E.M.的平均∆F/F0（％;实线）。（阴影区域）。定量图显示为最小/最大图，中位数为水平线。验证正态性后，对来自图和/或方法中指示的特定时间窗口的平均∆f/f0（％）数据应用了配对的t检验或配对的Wilcoxon签名级测试。不同的字母表示显着差异（p <0.05）。对于组间比较，使用单向方差分析，Kruskal-Wallis，T-Test或Mann-Withney检验对基因型和处理之间的差异进行了平均验证值。实验者并未对数据收集过程中的实验条件视而不见。同时和随机时间以及白天的随机时间对一个实验的基因型进行了测试，以避免昼夜节律时间点的任何影响和实验试验的顺序。我们重复了所有统计测试，这些测试不包括使用ROUD方法的Prism，Q = 0.5％，并始终获得相同的结果，因此我们没有排除离群数据点。TH-C1-GAL4和Split-GAL4系的表达模式，包括LC16，P1，TRHR23E12和PLP10，均在N = 4蝇中成像，并且在样品中可靠。

　　在实验之前，从未将动物预先分配给治疗或对照组。行为和成像实验与它们各自的对照组一起进行。在这种设计中未实施动物的随机化。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。