洛桑大学医院CHUV的机构审查和隐私委员会批准了研究，并根据《赫尔辛基宣言：CER-VD 2020-02204》的研究，用于使用皮肤样本的研究，以及使用CER-VD 2020-01257进行研究。对于19日的Covid-19皮肤样品，从2020年3月，从Covid Pandemic的开始就从CHUV住院，连续10例出现中度至重度Covid-19疾病和相关的皮肤表现。所有患者均对SARS-COV-2的鼻拭子进行阳性PCR检测，并进行了Covid-19的临床诊断。在扩展数据中给出了有关合并症，免疫抑制治疗，皮肤表现类型和时间的全面信息。此外，还提供了根据NIH序数尺度和顺序器官衰竭评估（SOFA）确定的最大疾病严重程度评分。该分数定义为（1）未住院而没有活动的限制；（2）未住院的活动和/或家庭氧气要求；（3）住院但不需要补充氧气，不再需要持续的医疗服务；（4）住院，不需要补充氧气，而需要持续的医疗服务；（5）住院需要补充氧气；（6）住院，需要非侵入性通风或使用高流量氧气；（7）住院的接收侵入性机械通气或体外膜氧合；（8）死亡。对照皮肤样品包括CLE（n = 11），斑块型牛皮癣（n = 21），特应性皮炎（n = 16），地衣planus（n = 5）和健康皮肤（n = 4）的皮肤病变。在获得知情同意后进行所有患者活检，并在组织学上证实了该疾病的临床诊断。

　　对于肺部研究，包括自2020年3月以来在CHUV死于Covid-19的患者的八次验尸检查。所有患者均来自SARS-COV-2的鼻拭子和COVID-19的临床诊断。患者信息在内的患者信息包括合并症，免疫抑制治疗，爸爸的类型，症状持续时间，直到死亡和机械通气的天数，并在扩展数据中给出了图6和Berezowska等人的25。

　　为了在皮肤样品中评分内皮病，测量了浅表和中真皮中毛细血管后血管的外直径和内部直径，并计算了内皮肿胀指数作为两个直径的比率。

　　从杰克逊实验室获得了十二至60周龄的雌性K18-HACE C57BL/6J转基因小鼠（应变：2B6.CG-TG（K18-ACE2）2PRLMN/J）。小鼠分组饲养并喂养标准食物饮食。在18°C – 24°C的环境温度下，将小鼠饲养为每组多达五只小鼠的组，湿度为40–60％。从06:00到18:00，将小鼠保持在12小时的光线周期。随意提供食物和水。通过鼻内给药给小鼠1×104 PFU的SARS-COV-2。病毒接种是在麻醉下进行的，该麻醉是用盐酸氯化氯化物和咪达唑仑诱导和维持的，并竭尽全力将动物痛苦最小化。SARS-COV-2感染后，将笼子随机分配给媒介物和H-151治疗组，然后没有对实验者蒙蔽。腹膜内每天接受二甲基亚氧化二甲基亚氧化二甲基硫氧化二甲基磺氧化二甲基磺酰（DMSO）或200 µL PBS 5％Tween-80中的750 nmol H-151。在指示的一天对小鼠进行安乐死，并立即用20 ml冰冷的PBS解剖以进行心脏灌注。收集肺和大脑。每个肺叶的一半被固定在4％PFA中进行组织学分析，另一半被切碎并存储以进行进一步分析。对于生存研究，如上所述，通过鼻内给药给小鼠施用小鼠。当小鼠达到人道终点标准之一时，将其安乐死：（1）体重减轻25％以上；（2）麻痹；（3）严重的呼吸困难。动物实验得到了Vaud（瑞士）的诉讼的服务，并根据各自的法律法规进行了批准。

　　将小鼠的肺和大脑在VERO-E6细胞培养培养基中匀浆（DMEM + 10％FBS + P/S）。将均质的混合物以400克离心10分钟。分析上清液中的病毒含量。将Vero-E6细胞以每孔为2.5×105个细胞的密度为12孔板中。用PBS洗涤细胞，并用在细胞培养培养基中连续稀释的病毒接种。感染后一小时，将细胞用PBS洗涤，并用0.8％Avicel（GP 3515）在1：1的情况下覆盖，DMEM添加了4％的胎牛血清，200单位ML -1 Penicillin和200μgML -1链霉素。孵育72小时后，将覆盖层去除，并用PBS洗涤细胞，用4％PFA固定并用晶体紫罗兰色染色。

　　将福尔马林固定的石蜡装满（FFPE）皮肤块切成6μm切片，并放在幻灯片上。首先将切片脱水片并再水化，然后进行热诱导的表位检索（HIER），并用PBS 0.01％Triton透化切片。在室温下，用一抗染色（补充表1）染色2小时。为了进行免疫荧光分析，将切片用荧光标记的二级抗体（补充表1）在室温下染色30分钟。对于免疫组织化学，将切片用HRP偶联的二抗染色，然后用DAB染色和Mayer抗染色。对于RNA荧光原位杂交（FISH），根据制造商的说明，使用RNASCOPE多重荧光V2测定法在皮肤中检测到IFNB1 mRNA（Advanced Cell Diagnostics，Inc。）。如上所述，与小鼠抗人CD163（诊断生物系统）共同染色。使用Zeiss LSM 700共聚焦显微镜获取图像，并使用ZEN 2010软件进行分析。对于单元格量化，使用Pannoramic 250 Flash数字扫描仪（3Dhistech Ltd）进行数字化幻灯片，并使用CaseViewer 2.4软件的Quantcenter插件2.2对单元格类型进行了量化。

　　对于LOC样品，将固定的LOC用0.1％Triton，2％皂苷透化，并与2％牛血清白蛋白（BSA）的阻断溶液一起孵育1小时，持续1小时，然后在4°C的块缓冲液中与一抗（1：100稀释）过夜孵育。然后将芯片与二级抗体（1：300稀释）一起在室温下孵育1小时。补充表1中包含了主要抗体和浓度的列表。F-肌动蛋白在1 µm的远红（螺旋染色剂）中使用sir-Actin染料染色30分钟，并与Hoechst染色同时同时使用。

　　将小鼠肺切成3μm切片。将肺部炎症的程度定量为肺表面积的平均百分比，其中肺泡壁的平均百分比与至少50％的空域面积减少了50％，并使用每只小鼠三个肺切片对两个独立研究者进行了评估。根据制造商的说明，使用市售套件（Promega）进行TUNEL染色。使用Axiovision软件使用Zeiss Axioplan荧光显微镜进行成像。从每个肺部随机选择三个场。通过图像分析软件（ImageJ）执行的自动计数来量化TUNEL阳性细胞。

　　立即在液氮中切开4毫米的皮肤活检，并在-80°C下储存直至加工。使用TRIZOL/氯仿法和组织均质器（Thermo Fisher Scientific）分离RNA。所有分离的RNA的A260/A280值≥1.7，并在片段分析仪（Agilent）上分析了RNA完整性。将小鼠肺碎片裂解在Trizol（Thermo Fisher Scientific）中，并根据制造商的说明分离RNA。根据制造商的说明，使用Rneasy微型试剂盒（Qiagen）分离芯片片中肺芯片实验的细胞中的RNA。

　　使用Ncounter人类免疫学V2面板分析了600个靶标的mRNA表达，其中包括20个定制探针（纳米构成技术，美国华盛顿州西雅图，美国华盛顿州，美国华盛顿州）（纳米弦技术），使用100 ng的RNA每个皮肤样品RNA。在分析研究样本之前，该商业面板在内部进行了广泛验证，以获得准确性，可重复性和可重复性。在将其包含在分析中之前，对每个样本进行了质量检查。使用Nsolver 4.0（纳米弦技术）或Rosalind（Rosalind Inc.，San Diego，CA）对数据进行标准化和分析。根据NormQPCR R Library 49中实现的Genorm算法选择要用于归一化的管家探针。使用FPC R库（https://cran.r-project.org/web/web/packages/packages/fpc/index.html）使用PAM（围绕MEDOIDS围绕Medioids的方法进行分区）的最终热图基因聚类，以考虑到所有的方向和类型的角色和类型的角色和类型。然后计算每个基因的Z分数，以使所选患者生成热图并确定特定的分类器。

　　将来自健康个体的六毫米皮肤活检切成三个相等的碎片，一块被切成三块，而一块被切成薄片，以测量基线基因表达。将其余的两块培养在200μl的DMEM 10％FBS中，在存在或不在0.5μgml-1的H-151的情况下，持续15 h。然后将皮肤活检在TRIZOL中匀浆，进行RNA提取，然后进行纳米弦分析，如上所述。

　　使用组织匀浆器（Thermo Fisher Scientific）在Pierce Ripa缓冲液中裂解六毫米的皮肤拳活检。添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma）以防止蛋白质降解。三十微克裂解物用于通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）测量2'3'-cgamp浓度，并根据制造商的说明（Cayman Chemical）。

　　对于透射电子显微镜，将皮肤活检固定在2％戊二醛中，在0.1m的cacodylate缓冲液中，pH 7.4。然后将样品在1％OSO4/1.5％的二烷酸钾中固定在水上biDest中2小时，用乙酸铀酰染色（2％在蒸馏水中），在酒精中脱水（逐步为50-100％），沉浸在丙二醇氧化物中，并浸入糖中溶液中（Polcidyl eneroph erophers erophers erophers erophers eropter interores artisyl enterores artisery 48 hh 48 hh hh 48 H4 H hh hh 48 H4 H hh;GMBH，德国海德堡）。用超级机动体（Ultracut，Reichert Inc.，维也纳，奥地利）切割半薄和超薄的部分。将超薄的部分（30 nm）安装在铜网上，并在Zeiss Libra 120传输电子显微镜（Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）上进行分析，以120 kV运行。

　　对于小鼠肺样品，使用REVERTAID第一链cDNA合成试剂（Thermo Fisher Scientific）对RNA进行了反转录，并使用Maxima Sybr Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific in Quantstudio cornstudio cornstudio 6/7 qpcr仪器）以重复的逆转录（RT – QPCR）进行定量PCR。对于LOC样品，使用带有随机六聚体（Invitrogen）的Superscript IV第一链合成系统对RNA进行反向转录，并使用ABI PRISM 7900HT系统（Applied Biosystems）上的Sybr Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）制备RT-QPCR反应。通过熔融分析证实了扩增子特异性。底漆序列在补充表2中列出。

　　将SDS加载缓冲液与RIPA缓冲液中的肺裂解液混合，并在95°C变性10分钟。用10％SDS -PAGE分离裂解物，并转移到硝酸纤维素膜上。将印迹与抗P-P65（Ser468）（1：1,000稀释）和抗P-STAT1（Tyr 701）（1：1,000稀释）（细胞信号传导）和抗β-肌动蛋白-HRP（1：2,000稀释）一起孵育。用增强的化学发光底物ECL（Pierce，Thermo Fisher Scientific）可视化蛋白质，并使用Chemidoc XRS Biorad Imager和Image Lab Software成像5.1。图1中列出了未编写的图像。

　　原发性人肺泡上皮细胞（上皮细胞）和人肺微血管内皮细胞（内皮细胞）是从商业供应商（细胞生物制剂）获得的。所有芯片均与直接在LOC上的上皮细胞重构，而没有任何其他体外培养。在LOC设备中播种之前，将内皮细胞传递了3-5次。用至少两个供体的细胞进行实验。

　　根据制造商的说明，从匿名供体中获得了来自Buffy Coat（区域间输血SRC）的外周血单核细胞（区域间输血SRC），并使用Biocol分离程序分离。在将巨噬细胞播种在LOC设备中的一个星期之前，在补充10％FBS的RPMI的T-75烧瓶（TPP）中培养了一个冷冻保存的等分试样。使用阳性选择（CD14超纯隔离KIT，Miltenyi Biosciences）分离CD14+单核细胞，嵌入地下膜提取物（BME-2，Cultrex，Cultrex，Cultrex）的半球域中24-WELL平板中，并在RPMI培养基中培养的RPMI培养物中，在10％FBS人类中培养，并将其培养在20 ng Mim-1 ng MiMIngun ng MiMIn-1-1（M-CSF）和100 U L-1的青霉素 - 链霉素溶液（Thermo Fisher Scientific）。单核细胞分化了7天。在播种到LOC的那天，首先用P1000移液器刮擦BME圆顶。然后，通过每孔添加500 µL冰冷的RPMI培养基，将机械解离的水凝胶带到半流体状态。然后将BME-RPMI悬浮液以200克离心5分钟，在PBS中用1％BSA预先涂覆的15 mL猎鹰管中，并在冰上重悬于4–5 ml冰冷的细胞回收溶液中，持续20-30分钟。有时，将溶液用火抛光的玻璃移液器剪切，以确保从BME水凝胶中完全去除巨噬细胞。然后，用10 mL的RPMI培养基/10％FBS将细胞悬浮液洗涤两次，以去除细胞回收试剂的剩余痕迹。如果需要，有时将BME-2悬浮液在2-3 ml胰蛋白酶中孵育以去除BME-2的剩余片段，然后再次重复洗涤步骤。将分离的巨噬细胞重悬于上皮细胞培养基中，并通过40μm滤波器获得巨噬细胞的单细胞悬浮液。

　　根据供应商的说明，培养野生型和CGA-/ - THP-1细胞。将Thp-1细胞用5 ng ml-1 PMA分化3天，并在2 dpi下转移到LOC的血管通道。

　　HEK-293T细胞是D. Trono实验室的礼物。HEK-293T cells were transfected with pCMVDR8.74, pMD2.G plasmids and the puromycin-selectable pLKO.1-puro lentiviral vector containing the shRNA for human STING (5′-CATGGTCATATTACATCGGAT-3′) and human MAVS (5′-CAAGTTGCCAACTAGCTCAAA-3′) by the calcium phosphate降水法。在48和72小时收集含有慢病毒颗粒的上清液，通过超速离心进行合并和浓缩。通过直接向培养基中添加10μl，用慢病毒载体转导了原发性内皮细胞（用于刺痛和MAVS和MAVS的shRNA（用于刺激性的SHRNA）和原发性肺泡上皮细胞（仅用于刺激的shRNA）；转导的细胞通过在转导后48小时向培养基中加入1μgml -1紫霉素选择。

　　VEOE6细胞和SARS-COV-2的临床分离株是塔帕雷尔C. tapparel实验室的礼物。SARS-COV2/瑞士/GE9586/2020是从Geneva大学医院的Vero-E6细胞中的临床标本中分离出来的。感染Vero-E6细胞，并在3 dpi处收集上清液，在-80°C下澄清，等分并冷冻，然后在VERO-E6中被斑块测定法滴定。该手稿中用于LOC和动物实验的病毒分别处于Vero-E6细胞中的通道2和通道4。

　　LOC设备购自商业供应商（仿真）。对于未感染的对照中RT – QPCR测量的一小部分实验，使用了使用商业供应商提供的多孔膜（Biond）的多孔膜进行了内部制造的设备（但没有拉伸通道）。以前已经描述了建立LOC模型的详细协议24。简而言之，将设备涂在150 µg ml-1牛胶原蛋白I型（日本Atelocell）和30 µg Ml-1纤连蛋白（Sigma-Aldrich）的ECM溶液中。对于具有原代巨噬细胞的三分量模型，在膜基底外侧的内皮细胞播种之前，将分化的原代人巨噬细胞直接播种在PDMS膜上1-2小时，并在顶部的上皮细胞播种。对于ρ0内皮细胞的实验，将内皮细胞与DDC在感染前3-5天孵育3-5天。在静态条件下，将芯片与完全上皮和内皮培养基一起孵育过夜。此后，将流动 - 液界面（ALI）的介质流过血管通道，并将上皮面与补充有1 µM地塞米松（Sigma-Aldrich）的上皮碱培养基一起孵育。在接下来的2-3天内，每天将这种培养基替换。此后，将芯片保持在ALI的一夜之间，然后转移到SARS-COV-2感染的生物安全3（BSL-3）设施中。在这里，将含有病毒上清液的等分试样在没有FBS的上皮细胞培养基中稀释约20倍，以产生与400-600 PFU相对应的接种物，体积为30 µl。然后将该体积添加到每个LOC的顶端通道中，并将LOC在37°C和5％CO2下孵育一个小时。此后，LOC被送回Ali。对于用STING或VDAC寡聚抑制剂处理的LOC，H-151（1 µM） 感染后，通过血管通道灌注VBIT-4（1 µM），并在3天内保持。在指定的时间点终止感染，并处理用于RNA提取的LOC，或通过新鲜制备的4％多聚甲醛固定30分钟。

　　使用带有白光激光器的Leica SP8共聚焦显微镜对感染和对照LOC进行成像。用25倍水浸泡物镜（NA = 0.95，Leica）对LOC进行成像，并以相同方式标记的标准设置（Voxel尺寸227.27×227.27×300 Nm3）。随后使用Huygens Deonvolution软件（科学量成像）对Z-stack进行了反应，并使用Imaris（Bitplane）呈现3D视图。使用ImageJ渲染最大强度项目。以下参数用于在Imaris中生成表面，以可视化IFNβ，裂解caspase-3，巨噬细胞和p-sting。在每种情况下，对来自同一实验的未感染的对照芯片和/或受感染的芯片和/或处理的芯片进行了免疫染色和成像，以控制跨抗体等分试样，成像条件和显微镜的免疫荧光强度的差异。使用相同的Imaris参数分析了来自同一实验的芯片。图3B中的三细胞组件芯片，扩展数据图6B，IFNβ：手动阈值：110，平滑：0.455 µm。扩展数据中的三细胞组件芯片图6D，IFNβ：手动阈值：110，平滑：0.455 µm。图3C中的两细胞组件芯片，扩展数据图7b，IFNβ：手动阈值：45，平滑：0.455 µm。扩展数据中的三细胞组件芯片图6E，裂解的caspase-3：手动阈值：110，平滑：0.8 µm。图3C中的两细胞组件芯片，裂解的caspase-3：手动阈值：110，平滑：0.8 µm。图3d。中的两细胞组件芯片，p-sting：手动阈值：110，平滑：0.8 µm。图3B中的三细胞组件芯片，CD45：手动阈值：110，平滑：1 µm。图3G中的两细胞分量芯片，扩展数据图8D，IFNβ；手动阈值：30；平滑：0.455 µm。

　　通过在血管通道中滴入0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液（Gibco），然后是顶端通道，以依次的方式提取LOC设备的血管和顶部面孔的细胞。将细胞以300克离心5分钟，并用PBS溶液两次洗涤，以消除细胞外基质成分。然后将沉淀的细胞重悬于20 µl HEPES pH 8和5 mM Tris（2-羧乙基）磷酸的20 µL溶液中，并在95°C下进行热灭活10分钟，然后从BSL-3设施中取出，然后从BSL-3设施中取出，并在-20°C下储存在-20°C下以在-20°C下进行蛋白质核心的核心核心。在此，将细胞真空融合至接近干燥，并重悬于9μL的100 mM HEPES pH 8和10 mM Tris（2-羧乙基）磷酸中。首先将样品在95°C下加热20分钟，并永久摇动，然后在水浴中超声处理15分钟。用1μl的400 mm氯乙酰酰胺在黑暗中以永久摇动在37°C下用1μl的400 mm氯乙酰氨酰胺烷基烷基烷基烷基。使用400 ng质谱级胰蛋白酶持续摇动将蛋白质消化过夜。在C18 Stagetips50上脱盐所得的肽，并通过真空离心干燥。将肽在8μLHEPES100 mM pH 8中重构，并在室温下用3 µL的同醇标签（在纯乙腈中TMT 20 µgμl -1）标记90分钟。添加50％羟胺（最终浓度0.4％（v/v））15分钟，停止了标记反应。在所有样品中，将一小部分标记的肽的比例以1：1的比例混合，并用单个Shot Control液相色谱 - tandem质谱法（LC -MS/MS）进行分析以评估混合精度。根据此对照运行的结果，将其余标记的肽的含量相等地混合， 按照制造商的说明，使用Pierce高pH相位肽分馏试剂盒进行了真空中心和分馏分成8个分数。通过真空离心将八个馏分干燥，并存储在-20°C下。

　　将肽重悬于2％乙腈，0.1％FA中，并在Lumos Fusion Orbitrap质谱仪上进行分析，该质谱仪在线连接到Dionex Ultimate 3000 RSLC Nano UPLC系统。毛细或毛细菜（Apraim Pepmap C18，3μm100Å，2 cm×75μm的内径）用于样品捕获和清洁。在50厘米长的内部包装毛细管柱（内径75μm，reprosil-Pur C18-AQ1.9μm硅珠，Maisch博士）上，在150分钟的双相梯度上以250 nl min-1进行分析分离。使用3 s周期时间通过最高速度数据依赖性采集模式进行采集。首先以120,000的分辨率（以200 m/z）的分辨率获取，并通过0.7 m/z的隔离窗口选择了最激烈的父离子，并通过高能量碰撞解离（HCD）分裂，并通过标准化碰撞能量（NCE）为37.5％。以50,000的分辨率（在200 m/z）的分辨率获得碎片的离子扫描，然后在接下来的120s中排除了选定的离子。

　　使用Sequest，Mascot，MS Amanda51和MS Fragger52在Proteome Discoverer v.2.4中处理原始数据，以与由Uniprot人类参考蛋白组（版本2020_10）和Uniprot SARS-COV-2参考组（版本2020_10）组成的串联数据库。将酶的特异性设置为胰蛋白酶，至少需要六个氨基酸才能鉴定肽。最多允许两次丢失的切割，并在肽和蛋白质鉴定水平上施加1％的错误发现率（FDR）截止。对于数据库搜索，将氨基甲基甲基化（C）和TMT标签（K和肽N末端）设置为固定修饰，而氧化（M）则被视为变量。通过内部书面r脚本（v.3.6.3）处理结果的文本文件。应用了两个标准化的步骤：样品加载（SL）和M值（TMM）归一化的修剪平均值。SL归一化53假设整个TMT通道的总蛋白质丰度相等。因此，将所有光谱的记者离子强度汇总在一起，并根据此总和将每个通道缩放，以便每个通道的记者离子信号之和等于跨样品的平均信号。随后，使用软件包EDGER（v.3.26.8）54应用TMM归一化步骤。这个归一化步骤可实现这样的假设，即大多数蛋白质丰度不会在样品之间发生变化，因此，它根据这些假定的未改变的蛋白质丰度来计算归一化因子。使用R Bioconductor套件Limma（V.3.40.6，2020-02-29）55进行差异蛋白表达分析，其次是Benjamini-Hochberg多重测试方法56。P值低于0.00128（FDR< 0.05) and absolute log2-transformed fold change (log2FC) >0.5被认为是显着的。对于时间表研究，监测所有定量的蛋白质。用R bioconductor中的时间软件包定义了重要的时间动力学，该动态使用多元经验贝叶斯模型来对蛋白质进行排名57。可以比较复制的时课数据，以允许在时间点之间和时间点之间的变异性。MB.长的方法用于计算温和的Hotelling T2统计量，指定了一维方法（方法=“ 1D”），其中重要的蛋白质在时间过程中会发生变化。零假设是蛋白质的时间分布等于0。

　　统计分析在每个图中描述。对于结合几个组的实验，使用了普通的单向方差分析测试。使用Prism V.8.0软件（GraphPad）确定统计显着性。组之间的显着差异是通过事后Tukey的多重比较测试确定的，除非另有规定，否则p> 0.05被认为不是显着的。在仅比较两组时，使用学生的t检验或曼恩 - 惠特尼测试来评估P值。对于LOC研究，从给定的LOC的视野视为生物学重复，LOC的数量对应于重复实验的次数。图3D中的p-sting+内皮细胞的图像来自n = 2的视野n = 1 loc。线粒体的数据随Cristae形态损失而是来自n = 2感染LOC的N = 4内皮细胞的体积电子显微镜成像的代表性切片。从n = 3个独立实验中获得了来自患者样品的数据，并通过n = 2个独立研究者进行了组织学分析的定量。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。