所有研究和动物护理程序均根据机构指南进行，并经2019-244-6和2022-364批准的OIST动物护理和使用委员会批准。成年章鱼（O. laqueus，地幔长度约为3厘米）在冲绳式潮汐池中收集，并将其安置在与海水系统相连的12升储罐中，这些海水系统开放循环到海洋。为动物提供了丰富的环境，包括沙子，植物，岩石和珊瑚瓦砾，以及庇护所（Terracotta Pot）。

　　在评估了（1）由于（1）它们的紧凑型大脑和体型使其适合神经固定记录和灯页面成像的其他几种选择之后，仔细选择了Laqueus。Laqueus的大脑类似于拥有七个gyrus VL的沿海昼夜章鱼（扩展数据图3D）。VL占中央大脑体积的9.05％，略高于其他沿海夜间物种，例如经常研究的O. us.ulgaris和O. bimaculoides51。

　　在封闭的海水系统中进行了实验，循环过过滤的天然海水。每周两次对水进行机械和生物学上的过滤，紫外线灭菌，氧化并与新鲜的海水交换。除非另有报道，否则将温度冷却至22°C，在12/12-h的光/黑暗周期上进行照明，并具有30分钟的光强度。醒着时，在主观的夜晚，每周三次喂动物。为动物提供了为期2周的实验储罐适应时期。在白天正常休息之后，实验开始了。

　　低分辨率录音（图1B，G – J和扩展数据图2和5B）使用三个自定义拍摄室拍摄。每个室放置了一个4K摄像头（Basler ACE ACA4024-29UC，4,024×3,036像素，24 fps），观看四个透明的丙烯酸100×150×100 mm的坦克，使用12 mm镜头，每毫米分辨率为13.4像素。照明安装在四个坦克的两侧，带有白色LED日照明（Koval Smart Aquarium Light，300 mm，654 LX）和红色LED夜照明（Leimac Idba-HM300R，300×40毫米Barlight，129 lx）。除喂食期间，在储罐上放置了5毫米厚的玻璃盖，以防止动物逃脱。为了记录动物运动（图1C – F和扩展数据图1），我们将动物放置在透明的丙烯酸300×200×200毫米储罐中，配有庇护所（三维印刷和陶式锅），避难所入口面向坦克墙。摄像机（如上所述，24或30 fps）被朝向单身动物的避难所。灯（Leimac IDBA-HM300W，300×40 mm，3 klx）放在背心和/或侧面上。

　　使用PylonRecorder2（v.0.6）制作录音，使用在线硬件压缩到H264格式并写入固态驱动器。一台运行Windows 10的计算机配备了两张图形卡（Nvidia Quadro P1000和Quadro P5000），它们同时运行七个相机。

　　高分辨率录音（图1A和5）是通过在装有佳能宏观镜头EF 180毫米镜头上安装8k的摄像头（佳能EOS R5，8,192×5,464像素，30 fps），在gimbal上，并在单一动物上拍摄45°镜像（96°镜像）（96 pixels）。使用三个白色条灯（Leimac IDBA-HM300W，300×40毫米，3,933 LX）来点亮坦克。所有录音均使用以下相机设置进行：1/200，F32，ISO 3,200。因为由于事件是周期性的，所以随着录制的时间启动，在预期的时间之前几分钟开始，并在模式动力学停止后结束。以4K的分辨率（Basler Ace ACA4112-30UC，4,096×3,000像素，30 fps，30 fps，32.3像素 /毫米，1,000 Lx）以4K的分辨率拍摄了一对醒来和睡眠图案，使用50毫米镜头看着动物。高分辨率记录在24°C（室温水）上拍摄。

　　要将照明水平放置在上下文中，阳光明媚的阳光在1,000 lx时，日光范围从10到25 klx不等。当月亮不可见时，夜间光线水平从满月期间的大约0.3 lx到0.002 lx。动物睡眠时间，因为在各种实验照明条件下持续时间和间隔似乎正常（扩展数据图5）。醒着时，较深的皮肤图案并未在3 klx照明下出现，但在1 klx的照明下观察到。

　　为了测量唤醒阈值，使用螺线管固定在储罐壁上并由Arduino控制的螺线管（Arduino Mega 2560）进行机械刺激。相机和螺线管命中时间的同步是使用相机观看并看不见动物的红色LED完成的。使用放置在章鱼位置的水文（Dolphinear De200）校准刺激强度。刺激6、40和86 dBV的三种优势在活动式倒数锅中，QS和唤醒期间传递到章鱼。QS被定义为两次主动回合之间的间隔，其中章鱼的运动缺乏，平坦的姿势，光滑的质地，闭合眼睛和白色。所有试验均在12:00至17:00之间进行。

　　对于睡眠体内平衡，在睡眠剥夺开始之前，将章鱼连续记录48小时。第二天，每2-3分钟用画笔轻轻刷皮肤，从07:00到17:00保持清醒。运动，姿势升高和睁大眼睛被认为是清醒的指标。17:00之后，动物可以自由地行为。然后使用上述步骤重复睡眠剥夺第二天。剥夺后的行为随后记录48小时而没有任何干扰。对于主动回合中断实验，使用绘画刷中断了一个随机的主动回合子集。然后，在中断和不间断的“试验”中比较了以下回合之前的QS量。

　　为了测量昼夜节律，将章鱼适应12小时的光/暗周期2周。连续拍摄48小时后，它们受到连续日光的72小时或连续黑暗的72小时的约束。在此期间，喂食被停止，以防止活蟹线索。然后将动物切换回12小时的光/黑暗周期。

　　为了测量温度依赖性，使用连接到水循环系统的冷却器（POAFAMX AL-300）将行为拍摄系统中的水温度冷却至19、22和24°C。维持每个温度2天。通过关闭冷却器来达到较高的温度。使用温度传感器（Tinytag水生2 TG-4100）测量储罐水温。

　　在录音前3天以上，将动物麻醉（在过滤的海水中2％乙醇）进行，并且将远端的2-4厘米远距离缩短了手术，以防止它们去除未来的头部固定。用组织胶（HistoAcryl，B.Braun）密封伤口。遵循此过程，在配备了封闭海水循环系统的实验储罐中恢复的动物（上），它们可以在从麻醉中醒来时立即移动和进食。章鱼没有表现出疼痛的迹象（即手臂修饰行为52），因此没有应用局部镇痛，从而阻止了给药相关的压力和睡眠破坏。录制前一天，将动物的动物如上所述，头顶放在水中。用显微镜去除软骨头囊上的皮肤，软组织和肌肉。将带有杆子的三维印花塑料环粘在中央大脑上的头囊上，并用组织胶和牙齿光治疗粘合剂（3M，Transbond XT XT浅固化糊剂）。环的内部充满了硅胶密封剂（Kwik-Cast，WPI），以防止伤口接触海水。动物在录音箱中恢复过夜。在记录的那天，将动物麻醉如上所述。将一个小孔切入头囊以暴露中央大脑，并使用细镊子去除大脑周围的鞘。用硅胶密封剂再次覆盖环。将新鲜的海水洗在动物上，然后将其移至实验罐。然后使用金属棒将其固定。动物在暴露于新鲜海水的几分钟内从麻醉中恢复过来。在探测器插入过程中，录音箱中的水位降低了，将动物头顶的顶部放在水线上方。该动物的身体得到了水族馆羊毛滤垫的支撑。Neuropixels v.1.0探针柄涂有CM-DII （100μg至50μl乙醇，Thermo Fisher Scientific，CellTracker CM-DII染料）用于事后探针位置定位。该探针安装在电动微型操纵器上（新的比例技术，M3-LS）。去除固化的有机硅密封剂后，将神经偶像探针以200μmmin -1的速度降低到大脑中。录音的深度在实验之间各不相同。我们探索了一系列深度，插入站点和角度。降低后，再次将塑料环的内部装满了硅胶密封剂，并升高了水位，以便将动物的头部淹没。记录箱在室温（24°C）下以大约0.2 l min -1的速度循环充气的海水。

　　使用SpikeGLX软件（V.3.0）进行NeuroPixels录制。采样速率为2.5 kHz（用于LFP信号）和30 kHz（用于细胞外尖峰信号）。如行为录音（上面的行为拍摄，以1,034 Lx拍摄），使用4K摄像头同时拍摄动物的披风。视频通过从Arduino发送25 Hz晶体管传播器（TTL）信号来与电生理记录同步，以触发相机框架的暴露并使用SpikeGLX记录TTL时间。动物在开始记录后显示为12.7±6.6（S.D.）h，表明持续时间和间隔的回合与自由行为的动物相似（扩展数据图5）。

　　记录后，将神经质探针从大脑中取出，并通过将乙醇浓度从海水中的2％逐渐增加到5％，对动物进行安乐死。解剖了记录的动物的头部，围绕头囊的组织尽可能地除去。头囊中的大脑在4％的4％多聚甲醛中固定24-48 h。使用第二代立方方法清除解剖的脑组织53。首先，将组织在25°C的50％立方-L溶液中孵育过夜，然后在25°C下100％立方-L孵育24小时。PBS洗涤后，将组织浸入Bobo-1核染色染料（themofisher b3582; 1/800稀释）中3天。将组织用PBS洗涤，然后将其放入50％立方-R过夜，然后将100％立方-R置于24小时（扩展数据图3A）。清除的样品嵌入透明的琼脂糖凝胶中，以安装在显微镜上。为了扫描大脑，我们使用轴向扫射显微镜的技术定制了一个灯表显微镜54。显微镜配备了10倍检测物镜（Olympus XLPLN10XSVMP）和10倍照明物镜（Kyocera Soc Corporation，CS03-10-30-152）。用（x，y，z）=（0.65，0.65，2.5）分辨率获取图像。使用488 nm激发激光和536/40 nm带通滤波器对Bobo-1进行成像，而CM-DII则使用532 nm激发激光和593/40-NM Bandpass滤波器成像（扩展数据图3B，C）。

　　为了构建O. laqueus的参考大脑图集，我们按照上述过程清除并染色了成年章鱼大脑，并用（x，y，z）=（0.65，0.65，2.5）分辨率扫描了大脑。我们从整个大脑图像中裁剪了超植物学质量，然后将其缩小为（x，y，z）=（10，10，10）μm。我们使用3D slicer55手动注释了3D图像，引用了现有的解剖图谱为25,26（扩展数据图3D，E）。使用对称图像归一化方法（SYN）方法在高级归一化工具（ANTS）Library 56中实现的对称图像归一化方法（SYN）方法，将单个章鱼大脑的3D图像映射到此参考地图集56。在注册之前，将Bobo-1通道降采样至（x，y，z）=（10，10，10）μm。然后，使用3D切片机手动创建二进制面膜，并掩盖超植物食管以外的其他组织。然后通过两步转换将大脑映射到参考大脑。首先，计算仿射转化以将两个大脑大致对齐，以公制函数为准。其次，使用具有互相关作为度量函数的SYN算法计算非线性翘曲。In ANTs command line, the following parameters were used: --transform Affine[0.1] --metric MI[${fix_img},${mov_img},1,128,Regular,0.5] --convergence [1000x1000x1000,1e-5,15] --shrink-factors 8x4x2 --smoothing-sigmas 3x2x1vox --transformSYN [0.1,4.0,0.2] - 米特里克cc [$ {fix_img}，$ {mov_img}，1,6] - convergence [500x500x100x30,1e-6,10] - s-shrink-factors 8x4x2x1-smmoothing-sigmas-sigmas-sigmas 3x2x2x1x1x1x1x1x0vox。这产生了一个仿射变换矩阵和一个以四维矩阵给定的经纱场（扩展数据图3G）。我们控制了蚂蚁中的参数以防止过度的翘曲，这是由雅各布决定因素的值量化的（扩展数据图3G）。地图集和注册大脑被覆盖，显示视觉上精确的对齐（扩展数据图3F）。通过计算与4个体素的窗口半径（扩展数据图3H）来计算体素归一化互相关的值来量化对齐质量，该值在大多数区域显示正值，尤其是脑叶之间边界的高正值。我们还从n = 9独立排列的大脑中产生了平均核染色图像（扩展数据图3H）。维持叶结构，进一步支持我们的注册质量。

　　为了分析神经偶像探针的位置，首先将来自3D脑图像的CM-DII通道降采样至（x，y，z）=（5，5，5，5）μm。然后使用3D切片机手动标记CM-DII探针轨道。首先使用形态学对二进制对象进行骨架。SkeTORONIZE_3D函数在Scikit-Image库中实现，然后将所得的骨骼与B型平台拟合。然后，使用上面计算的转换将神经质子探针通道的XYZ坐标映射到参考空间。最后，每个记录通道都根据图集区域为一个唯一的区域ID分配。从CM-DII图像中确定探针深度有时是由于染料扩散扩散而导致的一个不平凡的问题。在先前的启发式治疗57之后，在映射后，我们检查了解剖区域边界处的特征LFP模式。如有必要，我们将探针位置沿深度轴移动，以增加LFP - 解剖对应关系。自动确定的位置通常非常准确，最大校正是十个通道（大约100μm）。

　　为了将大脑区域分为前半半部分（图4E插图），我们将每个大脑区域的前点和后点最小和最大值作为最小值和最大值，并将它们之间的中点计算为（min+max）/2。根据脑部中点的前还是后，通道分为前或后。

　　为了测量行为记录中的章鱼皮肤亮度（图1），我们使用预读取的基础模型（使用Mask r-CNN，R50-FPN，3×Schange），对章鱼训练数据集进行了细微的基础模型（使用Mask r-CNN，R50-FPN，3×Schedule），使用Beale detectron2 Platform58（V.0.1.3）对章鱼进行了分割。使用标签箱平台完成了训练集标签。为了加速数据处理，每100帧（4.16 s）对章鱼进行分割，并使用最近的前面分割在每个帧上计算平均强度。通过使用FFMPEG将视频切成1-H剪辑，独立运行每个剪辑，然后重新组合，并平行处理多天的视频。

　　使用QS期间的平均皮肤亮度痕迹检测到QS期间的颜色闪光。使用三极的Butterworth滤波器对迹线进行0.005–2 Hz的滤波，并在Z尺寸信号的负面检测到峰，最小峰高为2，最小突出性为0.5，最小分离时间为10 s。颜色闪光持续时间是通过将平均皮肤亮度迹线的窗口从500帧（21 s）中拿走，然后在峰值之后的1,000帧（42 s）中取出。这个时间序列是z得分的，峰值时间两侧的阈值交叉（2z）被视为开始时间和结束时间。

　　在睡眠时间，持续时间和间隔，AS和QS时间是使用平均皮肤亮度记录以及视频确认的。手动同样识别唤醒时间。随着事件间的间隔，在动物没有醒来的回合之间计算了。由于持续时间是通过考虑前10 s的窗口和100 s之后确定的，作为开始时间。这些时间序列是z得分的，低通使用的时间序列使用两极的Butterworth滤光片以0.1 Hz的速度过滤。最大的连续数据的长度落在阈值以下是AS持续时间。我们探索了一系列阈值（扩展数据图5D），以0.2的形式确定为视频数据的良好主观匹配。

　　图1i，J中的直方图使用了2-h的架，并通过使用S.D的高斯内核来平滑0.1-h binning来计算连续速率估计。40箱（4 h）。图2B使用1-H直方图套筒类似地计算。图2D使用了5分钟的箱形，使用核密度估计值（MATLAB“ KSDESTICE”）估算了概率密度。

　　为了进行运动分析，在唤醒阈值实验中（图2a和扩展数据图1G – I），我们在刺激时间之前提取了夹子1 s。在夹子的第一帧上从背景（如上所述）分割动物。在分割蒙版内，使用SIFT59键盘检测（对比阈值为0.05）检测出突出的特征。然后使用Lukas – Kanade光学流程60（窗口尺寸为512像素），以通过帧跟踪这些点。运动幅度计算为相邻帧之间的平均视频流量幅度。为了计算反动运动，在刺激后，从平均幅度中减去25帧（1 s）的刺激时间之前的25帧（1 s）的基线平均幅度。

　　为了分析QS和AS的动物运动（图1C – F和扩展数据图1A – C），我们提取了以开始时间为中心的2分钟剪辑。眼睛，身体和前地幔（用于测量呼吸）是从该夹子的第一帧手动分割的。对于每个分割蒙版，分别计算出运动幅度，分别计算出上述。为了隔离眼睛的整体运动和呼吸运动，从每个框架中去除眼睛/前地幔面罩内的平均运动，我们报告了残留运动。从前地幔残留运动中提取呼吸速率，并通过Z级，平滑（10帧）迹线在峰值检测中检测到吸入率，峰值突出为0.05。然后将呼吸速率线性插值到视频框架速率。图1报告了夹子的前30秒（QS）和夹子的第三个30 s（AS）的平均运动幅度。在单独的30 s视频片段上计算出醒来动物的呼吸疗法的计算（扩展数据图1b）。

　　使用OIST的SAION HPC系统进行了行为分析，最多使用32 GPU（NVIDIA V100和P100）。核心分析以Python（V.3.6和3.7）的形式撰写，并使用MATLAB 2019a编写了进一步的分析。

　　通过从2.5重新采样到1 kHz来预处理LFP数据，过滤0.1-150 Hz，并通过减去从所有通道中的大脑中的十个通道的中值进行重新引用。使用Mortlet小波（MATLAB“ CMOR1.5-1”）的连续小波变换计算频谱图，对数间隔在1到100 Hz之间。通过将所有值除以最大值，将频谱图以幅度标准化。使用Chronux工具箱（v.2.12，http：//chronux.org/)61在非重叠的1-S块数据上计算光谱，其中具有五个和九个龙头的时间段落产品。然后将结果平均在数据块上。

　　为了计算不同行为状态下的通道强度，对不同的数据选择进行了统一的程序。对于AS，QS和清醒，加载了60 s的LFP数据，始于每个检测到的AS或WAKE阶段的过渡，然后以QS的时间为60 s。对于QS颜色闪光灯，加载了700毫米的数据块，以色相闪光事件为中心（如上所述检测）。数据加载后，每个记录通道的两个滤波器版本然后在0.1-10和20-150 Hz下生成。使用150-TAP Hilbert过滤器计算这些过滤信号的包络。通道的信号强度被计算为该包膜的平均值。我们中位过滤了五个以上的通道，以删除嘈杂的通道读数。然后，我们在所有事件中平均该向量。

　　对于QS振荡事件，在每次回合之前加载了1,200 s的LFP数据，并删除了所有唤醒事件（手动检测到的）。通过过滤数据4-40 Hz检测到QS振荡事件，然后在z尺寸信号中找到峰值，最小高度为两个，最小突出性为2，最小分离为1 s。根据数据块进行振荡事件率的估计并平均。然后用五通道中位过滤器将其平滑，如活动强度测量。为了计算大脑区域的LFP活性强度，我们对位于大脑区域内的所有电极的通道强度进行了平均。我们需要至少两个探针的数据来考虑大脑区域的活动强度。从这些大脑区域的所有电极上进行了不同活性强度测量之间的相关性。除非另有说明，否则使用三极底沃思过滤器进行过滤。

　　为了量化皮肤图案，我们开发了用于描述墨鱼迷彩28的技术。通过首先检测到章鱼地幔，使用detectron2 platform58来处理高分辨率章鱼视频。通过选择单个源图像并通过椭圆拟合和相似性转换将所有图像映射到此源图像上，从而对齐。前方向的确定是为了唤醒图像和视频剪辑的第一帧手动完成。然后将图像裁剪，然后将其降采样至1,004×675像素（裁剪后的图像大小为20％，以分段地幔），背景像素彩色均匀的灰色（如图4C中）。在标准预处理（零中心）之后，使用KERAS64平台（包括在TensorFlow V.2.0中），通过在ImagEnet63数据库上预测的VGG-19（参考文献62）网络评估了400×400像素的像素作物。我们将最大pool的第五层激活（“ block5_pool”）用作我们的皮肤模式metric65。这导致了512维矢量描述了视频剪辑中每个框架的皮肤图案。

　　通过通过帧矩阵计算512-FEATURE的第一个主组件，以及阈值其近似派生词的绝对值（相邻的时间点之间的差异，阈值0.1），通过计算512-FEATURE的第一个主组件来对齐AS轨迹动力学的起点。所有进一步的分析都是对启动时间对齐轨迹进行的。为了估算AS空间的维度，我们对从总数据集的10,000个随机选择的图像进行了并行分析66。为了估计不同动物模式在AS空间内的重叠，我们类似地计算了从总数据集中随机选择的10,000个随机选择的图像几次计算的Silhouette得分67。沿轨迹沿相邻时间点之间的平均欧几里得距离计算。从轨迹启动时间到较短轨迹的末端，在两个轨迹之间计算了两个轨迹之间的跨距离距离。动态时间扭动68后轨迹之间的距离被轨迹距离分开，以与非时代扭曲的对象间距离进行比较。通过将所有对轨迹的最小欧几里得距离在点之间的最小欧几里得距离中计算，可以计算最接近的反射率距离（在回合之间以及在唤醒图像和回合之间）。

　　为了使精选的清醒和皮肤图案对齐，手动从视频中提取了相似的图案。通过手动选择相应的点并使用移动最小二乘算法69在这些点之间进行插值来实现精确的对齐，从而产生从AS图像到清醒图像的映射。图像均匀且线性地亮以显示。AS图像中的绿色矩形（图5D和扩展数据图10）是近似作物（非线性映射）。为了显示覆盖的匹配，图像是灰色缩放，倒置和阈值的（在180–230时的8位灰度的图像特异性阈值），以显示深色模式区域。

　　除非另有说明，否则数据是平均值±s.e.m。对于盒子地块，利润率为25％和75个百分点；中线，中间；晶须，离群值之前的边界；离群值（+）是盒子边缘的1.5×四分位间范围以上的值。Experiments were repeated independently several times with similar results, with numbers of repetitions and sex (female or male) as follows: temperature modulation n = 9 animals, arousal threshold n = 5 animals, homeostasis n = 6 animals, active bout movement n = 3 animals, continuous light on/off n = 6 animals, electrophysiology n = 9 animals, skin pattern dynamics n = 3 animals and wake–sleep pattern matching n = 5 animals.

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。