HEK293T细胞和U2OS细胞是从ATCC获得的。在标准细胞培养条件下（37°C，5.0％CO2），将细胞保持在具有10％FBS，100 U ML-1青霉素和100μgml-1链霉素的DMEM（11995-065，GIBCO）中。如2012年在ANSI标准（ASN-0002）对人类细胞系的身份验证中所述的短串联重复（STR）分析，通过ATCC通过ATCC进行了身份验证细胞系。通过使用Lookout Mycoplasma PCR检测试剂盒（MP0035，Sigma-Aldrich），证实了细胞不受支原体污染。

　　设计了针对TRMT61A，TRMT61B和TRMT10C的shRNA，并在补充表3中列出了它们的序列。将所有SHRNA和对照非靶向的SHRNA都克隆到PLKO.1 vector的Agei/Ecori位置。1矢量（addgene，addgene，plasmid＃10878）和由sanger sequercencing sequerencing。使用PLKO.1/puro-shRNA与PLTR-G（Addgene质粒＃17532）包膜质粒和PCMV-DR8.2 DVPR（addgene质粒＃8455）封装质粒使用多型转染试剂（QIAGEN）一起转染细胞。48小时后收集病毒颗粒，并通过0.45μm无菌过滤器过滤。之后，用表达shRNA的慢病毒构建体转染细胞24小时，并用紫霉素选择7天。

　　使用TRI试剂（Sigma）从HEK293T细胞中提取总RNA。随后将RNA样品（〜20μg）与200μM的5'二甲基化的5×CTG寡脱氧核糖核苷酸（50 mM Tris-HCl，pH 7.0，750 mm NaCl，Nacl，1 mm Edta，1％％sds和15％sds Amamide for Roomsive for Roomsive）中的2倍（50 mm Tris-HCl，pH 7.0，750 mm NaCl，1％NACL，pH 7.0，750 mm nacl，1％pH 7.0，750 mm nacl）中孵育。然后加入所得的混合物，加入链霉亲和素偶联的琼脂糖珠（Thermo Scientific），并将悬浮液在4°C下孵育2小时。孵育后，将寡脱氧核苷酸核苷酸结合的珠用2×SSC缓冲液（0.30 m NaCl，15 mm柠檬酸钠，pH 7.0）洗涤四次，并将珠子重悬于RNase的无RNase水中以进行消化。

　　对于细胞下拉实验，将HEK293T细胞用标记为标记的TDP-43或5FL突变质粒转染。孵育24小时后，用PBS洗涤细胞，并在含有10 mM HEPES（pH 7.5），150 mM KCl，2 mM EDTA，0.5％Igepal Ca-630，0.5 mM DTT的缓冲液中裂解，蛋白酶抑制剂（SIGMA）和40 units ml -1 ml -1 ml -1 rnase rnase rnase rnase Inbistor。将上清液与4°C的抗FLAG M2珠（Sigma）一起孵育过夜。用含有50 mM HEPE（pH 7.5），200 mM NaCl，2 mM EDTA，0.05％Igepal CA-630和0.5 mM DTT的缓冲液洗涤珠3次。使用TRI试剂从珠子中提取TDP-43结合的RNA，并根据制造商的说明，使用多重吸引mRNA分离系统IV（Promega）分离并纯化mRNA。

　　将上述亲和力纯化的RNA（400 ng）用1个单位的核酸酶P1消化，其中25μl缓冲液含有25 mM NaCl和2.5 mM ZnCl2。然后将混合物在37°C下孵育2小时，并将混合物加入0.5单位的南极磷酸酶和3μL的1.0 m NH4HCO3。在37°C下孵育2小时后，将消化混合物干燥并在100μLDDH2O中重构。[13C5] - 腺苷，[D3] -M6A和[D3] -M1A分别用作RA，M6A和M1A定量的内部标准。同时，以相同的方式消化了总RNA（400 ng作为输入控制RNA）。使用氯仿：异氧化物（24：1）除去消化混合物中的酶，并通过乙腈沉淀去除样品中的盐。将所得的上清液干燥，并在10μLDDH2O中重构干燥的残留物，并在TSQ Altis三肢体质谱仪（Thermo）上注入LC-MS/MS分析。对于M1A和M6A量化，分别列和分析柱分别用多孔石墨碳和Zorbax SB-C18固定相材料包装，其中10分钟内的梯度为0-15％B，在30分钟内15-95％B，使用10分钟的95％B，在10分钟内使用95％B。质谱仪以多反应监测（MRM）模式运行，其中从[M+ H]+离子M6A，M1A的[M+ H]+离子丢失及其稳定的同位素标记的对应物。

　　RNase H用于去除（CAG）38重复的5'和3'侧翼RNA序列。特别是，通过加热至95°C并缓慢冷却至70°C，将分离的RNA在RNase H反应缓冲液（新英格兰Biolabs）中退火。温度在70°C下保持10分钟，以熔化非特异性RNA结构，然后缓慢冷却至37°C。将RNase H添加到混合物中，在37°C下孵育2小时，并用0.5 m EDTA终止反应。（CAG）随后通过亲和力纯化分离38个RNA，用酶消化，并通过LC -MS/MS分析，如上所述。除非明确指出，否则CAG重复RNA中M1A和M6A的水平没有RNase H处理。

　　以前描述了31,40的C57BL/6小鼠，表达了一只野生型内源性HTT等位基因和第二个带有人类MHTT外显子1的HTT等位基因，其中含有140个CAG重复序列。所有小鼠均在与国立卫生研究院指南一致的标准条件下维护和繁殖，并得到加利福尼亚大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会的批准。将笼子保持在12:12的光线上：黑暗周期，并随意食物和水。从六个月大的野生型和杂合HD敲入Q140小鼠中收获纹状体和皮质组织，并立即在干冰上冷冻，在干冰上使用了雄性和雌性小鼠的组织。Q19（AM49，RMLS172），Q40（AM101，RMLS110）和Q67蠕虫菌株（AM44，RMLS190）购自Caenorhabditis遗传学中心（CGC）。果蝇表达具有78个CAG重复（UAS-MJDTRQ78）的SCA3转基因，并且具有短（UAS-HA-MJDTRQ27 C19.1）CAG重复（Bloomington Drosophila Stock Center Line 8149）的果蝇（UAS-HA-MJDTRQ27线C19.1），已描述了transgene intergene insed insed inerrons lool 4（bloompophila stock Center Line 8149）。将野生型和催化性突变的人类AlkBH3的编码序列亚克隆到puast转化载体中，然后产生转基因飞行线（Chriiii，ATTP2）。从从小鼠纹状体和皮质组织，果蝇头和秀丽隐杆线虫中提取的总RNA中分离出CAG重复RNA，以与上述细胞RNA相似的方式消化和分析。

　　通过采用从相同仪器条件下分析的纯核苷标准标准获得的校准曲线来量化RA，M6A和M1A的水平（补充图2和3）。我们还评估了通过混合（CAG）7-0M1A与（CAG）7-1M1A和（CAG）在定义的M1A/RA/RA和M6A/RA摩尔比例定义的（CAG）7-1M6A中测量CAG重复RNA的分析工作流程的恢复率，并通过M1A和M6A的级别进行了分离，并将其量化与M6A和M6A的级别相同，并在隔离的情况下进行了隔离。M1A和M6A的回收率分别为约85％和87％（补充图12）。鉴于相对较高的恢复率，报告的M1A和M6A的测量结果没有校正回收率。

　　用质粒编码FLAG-TDP-43或FLAG-TDP-43-5FL与指定的CAG重复质粒一起转染HEK293T细胞。将细胞以70–80％的汇合收获，用PBS洗涤，并在Cellytic M细胞裂解试剂（Sigma）中裂解。将裂解物在4°C下以13,000 rpm离心10分钟。通过与链霉亲和素偶联的琼脂糖珠（Thermo Scientific）在4°C下孵育1小时，预先清理上清液，并将20μl样品作为输入。在室温下，在含有蛋白酶和RNase抑制剂的杂交缓冲液中，将生物素化的RNA诱饵（3 µg）在室温下孵育4小时。然后将链霉亲和素偶联的琼脂糖珠添加到混合物中，并将混合物在4°C的振动膜中保存2小时。将珠子广泛洗涤并煮沸10分钟，并收集上清液。随后将样品通过10％SDS -PAGE解析，并转移到PVDF膜（Durapore膜过滤器，0.45μm，Millipore）。将膜在室温下在5％的牛奶中封闭1小时，然后在4°C下在5％BSA中与原代抗体孵育过夜。Primary antibodies for the following proteins or epitope were used: TDP-43 (Proteintech, 10782-2-AP, 1:1,000), G3BP1 (Proteintech, 66486-1-lg, 1:1,000), TRMT61A (Thermo Fisher, A305-858A-T, 1:1,000), Flag epitope (Cell Signaling Technology, 14793 S,1：2,000），ALKBH3（细胞信号技术，87620，1：1,000），GAPDH（Santa Cruz Biotechnology，SC-32233，Immunoblot，1：5,000）和α-微管蛋白（Santa Cruz Biotechnology，SC-32293，1：5,000）。用含有0.05％Tween（PBS-T）的PBS洗涤后，将膜与室温下的二抗孵育1小时。用于蛋白质印迹的二级抗体包括在山羊（Sigma，A0545，1：2500）中产生的抗兔IgG（全分子） - 过氧化物酶抗体，M-IgGκBP-HRP（Santa Cruz Biotechnology，SC-516102，1：2500）。然后用PBS-T洗涤膜，并使用LI-COR成像系统可视化条带，并使用ImageJ进行量化。所示的所有蛋白质印迹都是从至少三个生物学重复获得的代表性结果。

　　如所述，进行了TDP-43的洗涤剂溶解度分馏。简而言之，将细胞用冰冷的PBS洗涤一次，并用Cellytic M细胞裂解试剂（Sigma）裂解，并在冰上孵育10分钟。在冰上进行短暂超声处理后，将裂解液在4°C下以15,000克离心40分钟。将上清液收集为洗涤剂 - 溶剂分数。随后将颗粒重悬于尿素缓冲液中（30毫米Tris pH 7.5、7 m尿素和蛋白酶抑制剂鸡尾酒），在冰上短暂超声，在室温下以15,000克离心1小时，在那里将超级中断的裂解物收集为尿液，将其收集为尿布液体，尿素液体，尿布素。然后通过SDS-PAGE解析去污剂 - 溶解和不溶性部分中的蛋白质，并通过Western blot分析。

　　重组TDP-43蛋白通过以下先前描述的程序纯化43。用于纯化全长TDP-43 – MBP – 6×HIS TDP-43-5FL – MBP – HIS，TDP-43-5FL – EGFP-MBP – MBP – HIS和TDP-43-Δlcd-ucd-Δlcd-egfp-egfp – egfp – mbp – mbp – mbp – mbp – mbp – his蛋白，bl21-de3 esCheriaia at An od and od and od and od and inm od and inm and od cortiatiaty and od and inm od and。为0.6-0.9，并用1 mM异丙基β-1-1-甲状腺乳糖苷糖苷（IPTG）在18°C诱导16小时。随后将细胞收集，沉淀并重悬于含有20 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 M NaCl，10％（V/V）甘油，1 mM DTT和EDTA无蛋白酶抑制剂蛋白酶鸡尾酒的结合缓冲液中。通过超声处理裂解细胞，并以10,000克离心20分钟。将蛋白质纯化在预包装的葡萄蛋白Sepharose高性能MBPTRAP HP（MBPTRAP HP柱，GE）上，并使用含有10 mM麦芽糖的结合缓冲液洗脱。在预包装的Ni Sepharose高性能Histrap HP（GE）上进一步纯化蛋白质，并用含有50 mM Tris（pH 7.4），500 mM NaCl和400 mM咪唑的缓冲液洗脱。蛋白质浓度通过布拉德福德测定法（Bio-Rad）确定。通过使用变性SDS -PAGE分析洗脱级分，并通过SDS -PAGE分析评估重组蛋白的纯度。

　　遵循先前描述的程序44，在3'末端将RNA探针，5'-biotin-ccgccgcccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgcccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgccgcgccgcgcgccgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcagcuggaaugca-3'（其中x = m1a，a或m6a;补充表2）在3'末端进行了放射性标记。44。简而言之，通过孵育0.5μl0.5μl0.5μl0.5 mm cytidine-3'---磷酸（CP，Carbosynth）与1.0μl10×10×T4 PNK Buffer（Neb），1-lim t4 pnk（3），制备了[5'-32p] cytidine-3'，5'-Bis（PCP）（PCP）（PCP）8.25μl[γ-32p]在37°C下ATP 1小时。将混合物在65°C下孵育10分钟。将RNA探针在含有3μl10×T4 RNA连接酶缓冲液（NEB）的30μl缓冲液中标记为3'-末端（NEB）在4°C下24小时。然后使用微型生物旋转P-30色谱柱（Bio-Rad）纯化探针。此外，通过遵循标准程序，在5'末端将带有或没有M1a的合成21-MER（CAG）7 RNA（补充表2）在5'末端标记为32p，并用于EMSA实验。简而言之，在结合缓冲液（10 mM HEPES，pH 8.0，50 mm KCl，1 mm kcl，1 mm EDTA，1 mm EDTA，5％甘油，5％甘油，1 mm dtt，1 mm dtt，1 mm dtt，1 mm dtt，40 units ml -1 ml -1 rnase rnase Inbibitor）中，探针（20 fMOL）与浓度的TDP-43或其截短或突变变体孵育4°°C。将整个20 µL样品在8％的天然聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并使用台化9410可变模式成像仪使用磷光受益剂分析对凝胶带强度进行定量。使用Prism软件（版本8.0.1）计算解离常数（KD）。

　　为了定量具有不同长度的CAG重复长度的U2OS细胞中TDP-43颗粒大小，使用甲醇和20-35个颗粒固定细胞，每个条件分析了20-35个颗粒。列举了RNA颗粒，并计算了与应力颗粒标记（G3BP1）共定位的颗粒的百分比。使用斐济中的图谱工具计算共定位的颗粒的强度和面积。

　　使用LSM 880激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss 880倒立的飞机扫）与温度 - 湿度和CO2控制的顶级孵化器进行实时成像进行FRAP实验。光漂白是由氩激光器以50％功率的488 nm线进行的。这些实验定义了三个感兴趣的区域（ROI）：ROI-1是液滴中指定的圆形区域；ROI-2是同一液滴中相似大小的圆形，未透明的区域。ROI-3被定义为背景，并在液滴外绘制，从而从ROI-1和ROI-2中减去其信号。使用棱镜处理并绘制原始数据。

　　转染后24小时固定表达指示RNA的U2OS细胞，并在含有10％（v/v）乙酸的甲醇中孵育10分钟。使用Cy3标记的DNA探针（5' - /5CY3/ctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctg-3'）检测RNA。杂交和洗涤缓冲液从BioSearch Technologies获得，并按照制造商的协议使用。For immunofluorescence detection of proteins following RNA-FISH, methanol-fixed cells were stained using antibodies against TDP-43 (Proteintech, 10782-2-AP, 1:100) and G3BP1 (Proteintech, 66486-1-lg, 1:100), and Alexa Fluor 488 and 647-labelled secondary antibodies (Invitrogen,A-32731，1：250和Invitrogen，A-32728，1：250）。如上所述，将样品随后用DAPI染色，并使用共聚焦显微镜成像。使用Zen 2 Blue软件（版本2.3）分析数据。

　　在含有20 mM HEPES（pH 7.4），300 mM KCl，6 mM MGCL2、0.02％NP-40和50％甘油的缓冲液中诱导体外TDP-43液滴形成。葡聚糖（10％）也被添加为拥挤剂，以诱导TDP-43的相分离。使用共聚焦显微镜使用100×油浸入物镜检测盖玻片上的液滴。在添加M1A-RNA后TDP-43液滴形成后，根据稳定形成的TDP-43液滴计算分区系数，基于相位分离液滴中TDP-43的强度比位于立即相邻区域中的TDP-43的强度比。

　　从J. Finer-Moore45提供的菌株中分离出表达质粒PET17B-6×HISTRM6-TRM61，并经过修改以包含3C蛋白酶裂解序列C-tag序列C-末端至6倍他的标签。按照先前所述的程序纯化重组TRMT6 – TRMT61A 45。对于甲基转移酶测定，首先加热至95°C，将合成（CAG）16 RNA退火5分钟，然后冷却至25°C。反应在室温下在含有50毫米乙酸铵，3 mM MGCL2、50 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 mM DTT，1 mM S-甲基甲硫代氨酸的20μl缓冲液中进行过夜，并进行反应。反应后，通过氯仿提取去除蛋白质，然后通过核酸酶P1和南极磷酸酶消化RNA，RA和M1A的水平通过LC -MS/MS测量，如上所述。

　　除非另有说明46，秀丽隐杆线虫菌株在20°C的标准线虫生长培养基平板上保持在带有大肠杆菌OP50细菌的植物。补充表4提供了本研究中使用的菌株列表。

　　为了产生转基因秀丽隐杆线虫菌株（WG291和WG300；补充表4），表达由泛神经元SNB-1启动子驱动的人类AlkBH3（HalkBH3），我们克隆了SNB-1基因上游的1.5 kb DNA的DNA，该基因在任何脉络脉络上特定表达。人AlkbH3基因的cDNA从HEK293T细胞中获得，并通过PCR扩增。将两个内含子插入ALKBH3中，以避免误导。该ALKBH3-WT cDNA用于位置定向的诱变实验中，以生成ALKBH3的催化无效突变体。将蓝色荧光蛋白（BFP）融合到ALKBH3的C末端，以监测蠕虫中AlkBH3蛋白的表达。通过采用PCR步行技术并插入PCR2.1-TOPO（Thermo Fisher），将所有带有TBB2 3'-UTR的片段均连接。底漆序列在补充表1中列出。将质粒与ROL-6（SU1006）主要标记物质粒PRF4一起注入到早期雌雄同体的生殖细胞中，其中注射混合物包含PRF4和AlkBH3质粒质体的每个50μgMl-1。以这种方式产生的转基因菌株的F1后代具有实验质粒和标记质粒的遗传外多拷贝阵列，并用于显微镜评估。使用ImageJ定量神经元之间的间隙。

　　对于RNAi实验，W02A11.1 RNAi构建体是从Vidal RNAi库中获得的。雌雄同体的蠕虫被喂食大肠杆菌OP50，其中包含空对照载体（L4440）或表达双链RNA时，它们达到了成年48。通过补充高压灭菌后的100μgml -1甲苯胺和1 mM IPTG的琼脂来制备用于RNAi分析的板。除非另有说明，否则将蠕虫同步并通过在RNAi喂养板上孵化而生长。通过具有逆转录和蛋白质印迹的定量PCR来验证RNAi效率。

　　所有统计分析均在GraphPad Prism（版本8.0.1）或Microsoft Excel 2016中进行。显着性定义为导致p值小于0.05的任何统计结果，除非另有说明为23,49。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。