冈比亚大杆菌G3蚊子被安置在笼子里的笼子中，该昆虫在27°C保持湿度为70-80％，湿度为12小时的光周期。为殖民地笼子提供水，10％w/v葡萄糖溶液，并随意捐赠人血（研究血成分）每周一次进行菌落维持。对于本文描述的实验，收集了G3 p，并将其放入笼子中进行叶子，然后向成年蚊子提供水和10％w/v的葡萄糖溶液，直到实验时间为止。所有实验均使用年龄匹配的雌性蚊子（4至7天）进行。

　　Wild-type NF54 P. falciparum (used in accordance with a material-transfer agreement from the laboratory of C. Barillas-Mury) was used for all experiments in this article, with the exception of the following experiments: (1) the Dd2 CytB I22L and TM90-C2B CytB Y268S mutant lines (both courtesy of the laboratory of M. Riscoe) used for cross-resistance分析;（2）通过ELQ选择产生的CYTB V259L，V284L和M133I抗性NF54线。通过全基因组测序对野生型和突变的NF54细胞系进行身份验证。DD2 I22L通过Sanger测序33验证，TM90-C2B是临床分离株34。测试了所有细胞系的支原体污染，TM90-C2B均为支原体阳性（所有其他均为阴性）。在RPMI 1640的0.2至2％寄生虫中，无性血液阶段的寄生虫与谷氨酰胺和25 mM HEPES培养基（康宁）（康宁）保持在10 mg L – 1低黄嘌呤，0.2％碳酸盐酸钠和10％热灭活的人类血清（相互血液库中）和5％hemattate HemaT（5％hemattate froll in Flool Bank）中，并在5％的血液中（5％）孵化器保持在37°C，气体成分为5％O2，二氧化碳和平衡N2的孵化器最多为2个月49。通过将寄生虫血症提高到> 2％，并在每天培养基中培养14-20天，以每天的介质变化以累积V阶段的VAGAMETOCYTES 50。

　　A. gambiae G3蚊子（4-7天）在14–21天的恶性疟原虫NF54诱导培养物中喂食，其中含有V级的V型配子细胞在37°C的定制玻璃，水剥落的膜喂食器中保持在37°C。允许蚊子进食长达60分钟，然后将其放入定制的感染手套箱中，以进行生物安全遏制（惰性技术）。任何未完全启动的蚊子都被吸入80％乙醇，并从随后的实验中取出。向蚊子提供水和10％w/v的糖溶液，以在实验的持续时间内为多重供电，并将房间保持在27°C下，在12小时的光周期循环中，湿度为70–80％。

　　为局部应用筛选文库中的每种化合物制备DMSO库存（100 mm），并在-20°C下存储在单个等分试样中。在局部应用当天，DMSO库存在丙酮中解冻并稀释1:50，以制造最终的2 mm和2％V/V DMSO工作解决方案。还以这种方式制备了2％DMS​​O控制溶液。我们选择了这种筛选浓度，以最大程度地限制在蚊子上的化合物量，同时最大程度地减少DMSO浓度。对于在100毫米DMSO下不溶性的化合物，直接从2％V/V DMSO和丙酮的粉末中制备了2 mM工作溶液。在极少数情况下（在补充表1中指出），对于在100 mM DMSO下不溶性的化合物，从饱和的DMSO库存中制备了工作溶液，以最大化最终筛选浓度（最大溶解度限制的最大溶解度极限小于2 mm）。将雌性A. gambiae G3蚊子（年龄4-7天）在冰上麻醉，并直接将吸管直接移液到背胸部。将蚊子从冰中取出，放入笼子中以恢复4-6小时，然后得到传染性的血液粉。所有化合物均已筛选一次，并在第二次生物学复制中至少再次测定了寄生虫患病率初步降低的化合物，以确认活性。

　　如前所述3进行了tarsal-contact分析，但进行了一些修改。通过计算1 mmol M – 2的6厘米直径玻璃培养皿（0.02827 m2总表面积）涂上6厘米直径的玻璃培养皿（0.02827 m2总表面积）所需的化合物来制备tarsal-contact板。该浓度大约为10×先前描述的Atovaquone Tarsal-Tarsal-Contact Ec99 value9，我们认为这种高浓度将能够检测活性化合物。称重粉末化合物并将其溶解在丙酮中，并根据需要稀释，以达到计算出的表面区域浓度。接下来，辅助梅罗的100 mg M – 2（也称为菜籽酸酯和乳化剂乙氧基酯（7）tridecanol（RME），也已向每种溶液中添加了一种来自H. Ranson的礼物），此前已显示出来在蚊子tarsal-Contactactact Assays Assays Assay51中被证明是一种在蚊子中摄取的摄入剂。对于ELQ-453 – ELQ-613组合暴露，制备了溶液，因此总复合浓度为1 mmol M – 2，由0.5 mmol M – 2 ELQ-453和0.5 mmol Mmol M-2 ELQ-613组成。将储备溶液串行稀释，以制备较低的浓度板，以进行tarsal接触剂量 - 反应曲线。最终的1 ml丙酮溶液含有100 mg M – 2 RME和所需浓度下的化合物的最终丙酮溶液被吸引到6 cm的玻璃培养皿上。还准备了100 mg M – 2 RME控制板。将板放在室温下在轨道振荡器上将盘子完全蒸发，以完全蒸发丙酮。第二天，将板安装有透明的塑料盖，以在暴露期间含有蚊子。雌性A. gambiae G3蚊子（4-7天大）被吸入暴露设备6分钟。一次暴露出最多25个蚊子，以最大程度地减少拥挤，并使所有蚊子都与涂有药物涂层或载有载体的表面接触。在每个实验中， 对蚊子进行视觉监测，以确认与涂层表面的骨接触。我们没有观察到明显的过度飞行或其他明显的回避行为迹象，尽管没有经验记录。6分钟后，蚊子被释放到笼子里，并在1小时后提供感染性血液粉。对于感染后的tarsal接触，如前所述进行了暴露。4。在传染性血液粉后3天，如上所述，将蚊子转移到暴露设备中，然后在6分钟的tarsal接触暴露暴露后，通过口腔吸入将它们转移到新的笼子中。对于薄膜和倾斜的网状tarsal接触，如上所述进行了曝光，并使用安装在聚乙烯薄膜或浸入净净蚊帐的6厘米直径塑料盖上进行曝光。

　　白色聚酯网（12.5×12.5厘米）用于网上的TARSAL-CONTACT分析。最初，网中浸泡在丙酮中，然后允许干燥30分钟。在此时间之后，将网络浸泡在丙酮或单独的丙酮中（对照）中的等效量ELQ-453和ELQ-613中浸泡，以达到所需的ELQ MG MG M – 2浓度并摇摆，直到吸收整个溶液。允许网上在平坦的表面上气动过夜，并在第二天进行tarsal-contact分析。

　　对于所有卵囊数据，在7 D.P.I.时，将蚊子吸入80％乙醇，在–20°C下孵育10分钟，然后在室温下转移至1×PBS进行解剖。将中肠剖分为1×PBS，通过将DDH2O中的0.2％w/v汞二溴氟二钠disodium盐溶液（Mercrohrolome，Sigma-Aldrich）转移到0.02％W/V mercurolomemoscopicy中。在奥林巴斯倒置的CKX41显微镜上成像中肠，并以×100放大倍率计数。对于感染后的实验，使用ImageJ软件fiji52测量了卵囊大小（横截面区域）。

　　在11或14 D.P.I.时，将蚊子从感染手套箱中的笼子中吸入80％乙醇，在-20°C下孵育10分钟，然后在室温下转移至1×PBS进行解剖。除去蚊子头，并解剖来自单个蚊子的唾液腺并在50 µL 1×PBS中收集。用小的手持杵机械地破坏唾液腺组织，并将10 µL加载到血细胞仪上。使用×100放大倍率的Olympus倒置的CKX41显微镜对孢子菌进行计数，并计算出每个蚊子的孢子虫的总数。

　　如上所述，Cipargamin，M5717，ELQ-613或2％DMS​​O作为对照在传染性血粉之前局部应用于蚊子。在22 h.p.i.时，将每组10个蚊子吸入80％乙醇，在-20°C下孵育10分钟，然后在室温下转移至1×PBS进行解剖。将中肠血液完整地分解为1.5 ml含有100 µL 1×PBS的低层埃潘多夫管。中肠组织通过在大约20次上下轻轻移动中肠而破坏了中肠组织，直到明显释放出血液，并且中肠肿块不再完整。将此匀浆以300克离心5分钟，并丢弃上清液。将含有均质血液和中肠组织的沉淀重悬于100 µL的1×PBS中，用1：300小鼠抗PFS25（BEI资源）将与CF-488染料（Sigma-Aldrich）和1：500 Hoechst（AAT BioQueast）和30分钟的cf-488染料（Sigma-Aldrich）偶联的原代抗体偶联。孵育后，样品再次以300克旋转5分钟，并重悬于100 µL 1×PBS洗涤中。再次向下旋转样品，并重悬于最终体积的10 µl 1×PBS，将其安装在显微镜载玻片上（VWR）上，并在倒置的Zeiss Axio观察者Z1上成像，以×200放大倍率。根据寄生虫形态，每组大约有200个寄生虫被计数并归类为合子，中间反驳形式或Ookinete。

　　Female mosquitoes were exposed to test compounds (100 µmol m–2 ELQ-453, ELQ-456, ELQ-458, ELQ-613, ELQ-614, ELQ-618 and ELQ-465) through 6 min of tarsal contact as described above, transferred to new cages and provided with a continuous supply of water and 10% w/v glucose solution until the end of the experiment.然后在tarsal-contact暴露后的以下时间点收集来自处理过的蚊子的中肠：1、3、6、24和48 h。将每个时间点的十个蚊子吸入80％乙醇，并在冰上转移到PBS中并进行解剖。对于每个时间点，收集了5个整个中肠，并将其合并为1.5 mL含有400μl甲醇和2 mm玻璃珠的Eppendorf管，导致每个时间点2个技术复制。总共进行了两种生物学重复（每个都有两个技术重复）。将样品存储在-80°C直至均匀化。

　　具有与测试化合物相似结构的ELQ用作检测和定量的内标（IS）样品：Proprug ELQ-615及其活性形式ELQ-183，Prodrug ELQ-331及其活性形式ELQ-300。用甲醇中的每个标准的2 nm制备一个IS主混合物。接下来，将100μl的是主混合物添加到每个样品中，以获得总最终体积500μl。样品通过在2,400 r.p.m的冷块中跳动的珠子匀浆。1.5分钟，3次。均质化后，将样品在15,060 r.p.m上离心10分钟。在4°C。将含有提取物材料的上清液仔细地转移到新的1.5 mL eppendorf管中。在整个提取过程中，将样品保存在冰上。将准备好的上清液存储在-80°C，直到提交给哈佛中心进行MS分析。

　　所有溶剂均为LC -MS级（Millipore Sigma）。将样品蒸发至氮流中的干燥，并将其重悬于20 µL甲醇80％的水中。使用与1290 Agilent LC（Agilent）耦合的横鞋7500三倍四极杆质谱仪（AB SCIEX）对样品进行定量。将五个微量的样品注入了保持在55°C的动元C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，现象）中。移动相为A（水和0.1％甲酸）和B（乙腈和0.1％甲酸）。使用以下梯度：10％B持续5分钟，然后在13分钟内至100％B，在100％B中保持4分钟，然后在10％B处重新平衡2分钟。流速为0.3 ml min-1。该仪器在正面模式下以以下源条件为正模式：在40 psi处的气体1，在65 psi处的气体2，44时的窗帘气体，碰撞（CAD）在8时，温度在525°C下的温度，并在1,800 V处喷涂电压。请参见补充表3，有关多重反应监测的过渡，请参见补充表3。使用较短的清洁方法在每个样品之​​间注入一个溶剂空白。对于标准曲线，制备了一系列甲醇中的溶液，所有靶标的在500 nm处最高，连续12个稀释液。将每种溶液的一百个微量液添加到未暴露的中肠匀浆中。然后将标准曲线样品与样品一起处理。使用曲线下的区域对目标进行定量，以使用SCIEX OS分析（AB SCIEX）除以相应内部标准标准的量化器面积（AB SCIEX）。

　　NF54 parasite lines (obtained through a material-transfer agreement from the laboratory of C. Barillas-Mury) were grown at 4–5% haematocrit in fresh human erythrocytes (O+) in RPMI 1640 medium supplemented with 10% O+ human serum (heat-inactivated and pooled), 26.6 mM NaHCO3, 27.7 mM HEPES, 0.41 mM hypoxanthine and25 µg ML – 1庆大霉素。人血清和红细胞由州际血库提供。在1％O2下，在37°C下孵育培养物，二氧化碳和平衡N2气体。

　　为了产生CYTB突变体，NF54寄生虫暴露于各种CYTB抑制剂中，如下所示。将寄生虫暴露于2 nm atovaquone（M133i），5 nm或10 nm ELQ-121（V259L），5 nm或10 nm ELQ-400（分别为V259L和V284L），或ELQ-437 RECER RECER RECER RECER RECER RECER RECER RECER RECER RECER RECER RED RECER RED RED RED RECER RED RED RED RECERRED。对于ELQ-300，将寄生虫与50 NM ELQ-300（H12Q）一起孵育5周，然后去除药物压力以使寄生虫恢复。通过PCR（引物：MT-Cyb 5'Utr：Ggatgegaatgattgttgttcttttctttggg和motor：ttatatgtttgtgcttgggagc）和随后的sanger-cyby s h12q mt qiB，通过PCR（mt-cyb 5'Utr：ggatgatgaTgaTtgttctttggg），通过PCR（mt-cyb 5'Utr：ggatgatgaTgaTtgttctttggg）以及以下是s h12q MT，通过pCR（mt-cyb 5'Utr：ggatgatgaTgattgttctttggg），通过pCR（mt-cyb 5'Utr：ggatgaTgaTgattgttctttggg）来鉴定突变。全基因组测序如下所述。

　　从无性血液阶段培养物中收集了来自父母敏感的NF54和选定突变体的寄生虫样品，直接从感染性血液粉之前从无性血液阶段培养物和配子细胞培养物中收集。使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen）提取寄生虫DNA进行全基因组测序。测序图书馆由加州大学圣地亚哥分校基因组医学基因组学研究所中心使用Nextera XT Kit（FC-131-1024，Illumina），具有2 ng输入GDNA和标准双重指数。

　　将原始测序读数与恶性疟原虫3D7参考基因组（plasmodb v.13.0）排列，并按照标准GATK（v.3.5）协议进行了预处理。GATK HaplotypeCaller用于调用单核苷酸变体，插入和删除，这些变体和删除是基于以下排除标准进行硬过滤的：readPosranksum> 10.0> 10.0或<–10.0;质量深度<1.5;或映射质量排名总和（mqranksum）<–14。使用SNPEFF注释变体，并使用plasmodb（v.13.0）的3D7参考GFF构建的自定义数据库。Fisher的精确测试将每个样品中的参考与替代等位基因计数与其母体的替代等位基因计数进行比较，用于计算每个变体调用的P值，以帮助确定其在同一基因组基因座的药物敏感父母是否有显着差异。

　　通过使用GATK 4.0 CNV管道计算出跨基因间隔的log2拷贝比，从全基因组测序数据中检测到拷贝数变化（CNV）。在具有基因间区域的预定义基因间隔列表上计算每个样品的读数计数，并去除了高度可变的抗原Var，Rifin，Stevor和Surfin基因。对由30个独立测序的3D7父克隆（本研究中的父母线不包括）组成的正常小组进行了降级。如果至少4个顺序基因显示至少0.6的log2拷贝比，则保留CNV，这表明基因扩增或最多为-0.6，这表明缺失。ELQ121-NF54-R-ABS被排除在CNV分析之外，这是由于整个基因组的拷贝比极端变化。使用此方法未发现核心区域中的CNV。

　　如前所述，使用SYBR Green I Method54进行了药物敏感性测定。简而言之，在不同药物浓度的情况下，在384孔透明的底板中在384孔透明的底板中生长40 µL 0.5％血清完整培养基中的同步环和1％血细胞比容。所有药物条件均以三种技术重复进行，至少三个生物学重复。AA HP D300E数字分配器（Hewlett Packard）将药物分配为12点稀释系列。通过用SYBR绿色I（Lonza）染色寄生虫DNA 24小时，并在激发494 nm的激发下测量相对荧光单元，并使用Spectramax M5（分子设备）来测量相对荧光单元。使用对数（抑制剂）的非线性回归与响应 - 可变斜率拟合算法（V.10; GraphPad软件）中的响应 - 可变量曲线拟合算法计算EC50值。

　　所有统计分析均在GraphPad Prism（V.10.0； GraphPad软件）和JMP Pro 17（SAS Institute）中进行。实验样本量，随机化和盲目的基于先前发表的方案3,4，并在报告摘要中详细描述。对于局部筛查和次级tarsal筛选，使用Baptista-Pike方法计算了对照与化合物处理的感染率两侧或95％CI值的患病率。绘制了OR和95％的CI，任何具有较高置信区间<1的治疗组被认为显着降低了感染率。没有发现化合物显着增加感染率。在两种化合物（DSM161和DSM703）的情况下，对照组和化合物处理的组均具有100％的患病率。在这种情况下，应急表中四个单元格中有两个为0，并且无法计算或无法计算。因此，我们随意向未感染的细胞添加了1个，以计算和绘制估计的或绘制一个。我们类似地向未感染的MMV019881应变表池添加了1个，否则计算出的或上CI是无穷大的。对于感染实验，使用两尾Fisher的精确测试分析患病率，并使用两尾Mann-Whitney测试分析强度。在比较了两组以上的实验中，使用Fisher的精确测试进行了Bonferroni校正，分析了患病率，并使用Kruskal-Wallis测试分析了强度，并使用Dunn的HOC Post hoc Parecomparisons校正分析了强度。22 H.P.I.IFA，寄生虫发育阶段的数量（1，zygote; 2，反驳； 3，Ookinete）在20-22 H.P.I的中肠检测到经过处理的蚊子的Midguts（1库中的1个中肠； 5个生物学重复）。使用JMP Pro 17（SAS Institute）中的序数逻辑回归模型分析，并结合了“治疗”（对照（DMSO），Cipargamin，M5717或ELQ-613）和“蚊子样品”（嵌套在治疗中）。

　　QSAR建模使用了一组38种化合物（补充表2）。该集合包括在局部屏幕和atovaquone中与所选命中共享作用机理的化合物，该命中率显示了完整的活性（局部或= 0）。根据以下公式进行转换或局部平均值（因变量）：1 - [log（或局部）+1）]。该公式允许活动值落在0（最低活动）和1（最高活动）之间。分子工作环境（MOE）软件（V.2022.02；化学计算组）用于准备库，计算描述符并运行QSAR分析。在MOE中，将分子在pH 7处洗涤为主要电离形式，并应用能量最小化以从二维规范的微笑中产生三维结构。使用MACCS指纹将化合物集合细分为27个化学簇（85％相似性）。根据它们的活性值和化学簇，分子均匀分布到训练集中（85％，32种化合物）和测试集（15％，6种化合物）（补充表2）。总共计算了总共347个分子描述符（209 I2D描述符和138个I3D描述符）。使用应急模块（196个描述符）选择了与因变量更好相关的描述符。使用MOE的AUTOQSAR和QSAR进化代码构建了三种模型类型：部分最小值（PLS），主成分回归（PCR）和遗传算法 - 多种线性回归（GA-MLR）。为了防止模型生成期间的模型过度拟合，排除了低方差（阈值0.9）描述符，并且模型中的描述符数量限制为六个。在模型构建过程中，排除离群值（Z'得分限制为2.5）。使用确定系数（R2）和均方根误差（RMSE）评估每个模型的预测精度和拟合优度。评估过度拟合， 使用剩余的交叉验证（LOO-CV）方法进行交叉验证，给予和RMSECV。用相关系数评估了测试集的外部验证。局部活动获得的最佳模型是模型GA-MLR，而PLS和PCR的拟合度较差，并且不满足阈值外部验证参数。使用GraphPad Prism（V.10.0; GraphPad软件）绘制了比较观察到的值的相关图图。

　　本研究中测试的每个化合物的微笑被保存为表格文件，并使用仙人掌55命令行版本和Python 3.5（补充表4）查询。进行搜索以获取具有90％相似性阈值的类似物（flag -simnet -sdb），以及用于复合库和类似物的文献参考（flag -lit -slit）。从同义词的结果中提取了Cacti发现的化学名称和Scifinder CAS标识符（数值系列），并作为附加列输入，以便于访问。使用ChemDraw 22.2和Scifinder Cas-N Web工具获得了缺少条目的化合物。用仙人掌获得的公众参考已被手动确认，其中仙人掌发现与我们研究不同的靶标的证据。具有经过验证的目标的类似物用于验证，其余的过滤以降低仙人掌分析的复杂性。

　　补充信息和补充表5中提供了合成方法和小分子表征。

　　将LDPE聚合物（0.5 g）和25毫升的木质烯类组合在6厘米玻璃培养皿的盖中，并在150°C加热，直到聚合物溶解。有必要偶尔补充蒸发的二甲苯。然后将木板中的ELQ添加到该溶液中。缓慢蒸发多余的木糖烯，并使所得的粗聚合物膜被允许过夜。然后将6厘米玻璃培养皿的底部放在粗聚合物薄膜上。然后将组装的设备加热在热板上，重物放在培养皿的底部。允许使用实验室刮刀将含ELQ的挤出聚合物薄膜冷却并从培养皿盖上剥离。

　　HDPE颗粒（McMaster-Carr，7202n11）通过用液氮冷冻颗粒将颗粒冷冻磨成可流动的粉末，然后通过1.0 mm筛分的RETSCH磨坊磨碎冷HDPE，具有1.0 mm的筛子，以最大化混合效率和均匀性和均匀性，并提高HDPE的融化速度。称重，混合并物理混合直至均匀。将HDPE粉末和ELQ混合物置于进料器中，并喂入Haake Minilab（Thermo Electron）双螺钉挤出机，桶温度为150°C。将混合物通过3毫米直径的喷嘴挤出，收集并允许在环境条件下冷却。每个配方的收集的细丝都存放在一个密封的袋中，直到使用为止。将每个收集的配方丝切成大约5–7.5 cm的尺寸。C型在C型，Carver Press，带有两个不锈钢板，上面覆盖了铝箔和一个不锈钢垫片（正方形腔为10.16 cm×10.16 cm×0.08 cm厚），预热至150°C。然后将板从压机上取出，将7.5 g的5–7.5 cm切丝丝放置在板的中间（底部有一个板，插入细丝周围，第二板在细丝的顶部）。将模具放回卡佛压机中，并轻轻压缩1.5分钟。然后将样品按至2267.962千克（5,000磅），持续1分钟，4535.924千克（10,000磅）30 s。将板从Carver压机上取出，并在环境条件下冷却15分钟，并在模具顶部重量。这些电影被剥皮并存储在Ziploc袋中，直到进行Tarsal-Contact分析。

　　人类的全血是从健康的志愿者那里获得的，他们的研究用途符合根据机构审查委员会批准的协议（IRB 120160613，研究血液组件）批准的知情同意书的条款。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。