WT C57BL/6雄鼠（Harlan），Akita Mice29（Jackson RemarNo。003548）及其WT同窝型控件，DB/DB（Jackson strainNo。000697），OT-I（C57BL/6-TG（TCRATCRB）（TCRATCRB）1100mjb/j）（B6.CG-TG（TCRATCRB）425cbn/j），ZBTB46-DTR和PDK2/3/4 - / - 小鼠30被繁殖并维持在韦兹曼科学学院，在室温和正常湿度的标准日/夜周期下，在韦兹曼科学学院的标准日/夜周期中，可以访问舒适的食物，并可以易于使用。wt同窝仔作为对照。动物年龄为8-14周，并随机分配给组。所有实验均根据机构指南进行，并获得魏兹曼科学机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号05400622-2，02800321-1，04000520-2和14760619-3）。

　　小鼠在第0天和第1天通过腹膜内注射在PBS或PBS中接受100 mg kg -1 STZ（Sigma）作为媒介物对照，然后允许恢复2周，然后再进行进一步的实验步骤31。在每次实验之前，确认了注射STZ的小鼠中的高血糖。

　　我们使用了流感病毒菌株PR8（A/Puerto Rico/34，H1N1）或OVA（Siinfekl）-PR8（参考文献32）。对于PVM，我们使用了美国类型文化收藏中的VR-1819。使用异氟烷对小鼠进行麻醉，然后在指定剂量的PBS中在气管内感染50 µL病毒。如果动物符合机构准则规定的严重性标准，则每天对动物进行监控并进行安乐死。

　　使用肝素涂层的玻璃毛细血管将血液骨收集，转移到肝素涂层的管子上，并在冰上保持冰，直到在10,000g和4°C下离心15分钟。将血清转移到新鲜管中，并在-80°C下储存直至使用。通过将导管插入气管中，并用1 mL PBS冲洗肺部来收集BAL。将样品存储在冰上，直到在500克离心5分钟以去除细胞分数。将BAL流体储存在-80°C，直到进一步使用。为了检测抗病毒抗体，测量了病毒特异性IgM和IgG2B抗体水平的血清和BAL液；将96孔板（Maxisorp，Nunc）与PBS中的紫外线灭活流感病毒（PR8）涂覆，在4°C下过夜。将板洗涤并与PBS-1％牛血清白蛋白（BSA）一起孵育2小时，以进行阻塞。将来自单个小鼠的BAL液以0.1％BSA连续稀释，从BAL液的1：3稀释开始，血清1:50稀释，然后在室温下孵育2小时。将板洗涤五次，并与碱性磷酸盐标记的山羊抗小鼠抗体抗体抗体或IgG2B（南部生物技术技术，Inc。）在PBS中以0.1％BSA在室温下的PBS中的1：1,000稀释2小时。此后，将板洗涤五次，并加入底物p-硝基苯基（Sigma-Aldrich）。在405 nm处的酶联免疫吸附测定读取器（Bucher Biotec）上测量光密度。为了进行分析，使用非线性最小二乘回归模型拟合函数y = a×x/（b+x）+c分析抗体滴定数据，其中x是1/抗体稀释模型，a是ELISA中的饱和信号，B是ELISA中的饱和信号，B是在ELISA中获得50％饱和信号的抗体所需的抗体浓度。半最大有效浓度（拐点）， 随后，用来指示获得ELISA中饱和信号的50％所需的抗体浓度，然后用于执行统计测试。

　　通过腹膜内注射200 mg ml -1五核钠，对小鼠安乐死。肺部被冷PB灌注，并在去除后放冰。收集LDN，然后在37°C下用2 mg ML -1型IV胶原酶（Worthington）和1 mg Ml -1 DNase I（Sigma）在ISCOVE修改的Dulbecco的培养基（IMDM）中20分钟，然后在使用70 µM Celler使用10 mL pbs中，在ISCOVE修改的Dulbecco的培养基中（IMDM）中消化。将肺切割并用1 mg ML -1透明质酸酶（Sigma），25μgml -1胶原酶XI（Sigma），50μgml -1 liberase TM（Roche）（Roche）（Roche）和1 mg Ml -1 dnase I（Sigma）在37°°C的频率中，并在37°°C中通过37°C的频率，并以1 mg ml -1 dnase I（sigma）的速度消化。PBS。然后将细胞在500g下离心10分钟，并用10 mL的BS重悬于。将细胞在500克下离心7分钟，然后重悬于1 ml PBS中。根据制造商的说明，使用僵尸生存力染料（Biolegend）染色样品。使用1μgml-1抗CD16/32（Biolegend）1：200来阻断FC受体。细胞用以下抗小鼠抗体在指定的稀释液中染色：CD11C APC-CY7（N418）1：200，CD11B BV605（M1/70）1：1,000，Siglec-F PE（E50-24440，BD Biosciences）1：1,000，CD45 AF700（30-F11）1：1,000，CD45.2（104）BV711 1：200，CD4 PERCP-CY5.5（GK1.5）1：200，CD4（GK1.5）FITC 1：200，CD8（53-6.7）BV605 1：200，CD8（53-6.7）（TRFK5）1：200，IFNγPE-CF594（XMG1.2）1：500，LY-6G PERCP-CY5.5（1A8-LY-6G）1：1,000，MHC II类BV421（M5/114.15.2）（M5/114.15.2）1：1,000，CD64 APC（CD64 APC（CD64 APC）1：200，CD19（6D5）APC（1：200），CD90.2 BV605（30-H12）1：1,000，TCR-βAPC-CY7（H57-597）1：200，TCRγδPERCP-CY5.5.5（GL3）1：200，NK1.1.1 APC（NK1.1 APC（pk136，ebisciente）1：200，ebiscience）1：200，ebiscience）1：200，ebiscience）1：200，200，200，ebi science 1：200，ebiscience）1：200，ebisfir（Mar-1，Thermo Fisher科学）1：1,000，XCR1 BV510（ZET）1：500，GATA3 BV421（16E10A23）1：100，RORγTPE（AFKJS-9，Thermo Fisher Scientific）1：1,000，IL-1,000，IL-17A PERCP-CY5.5（IL-1,000）（Ebioscience， eBio13A) 1:200, T-bet PE_Cy7 (4B10) 1:800, FoxP3 PE (MF-14) 1:200, CD40 (3/23) PerCP 1:100, CD80 PE-Cy7 (16-10A1) 1:200, CD86 PE-CF594 1:1,000 (GL-1), F4/80 (BM8) PE-Cy7 1:200, Ly-6C PE-Cy7（HK1.4）1：1,000，除非另有说明，否则全部从Biolegend购买。BV421偶联的肽-MHC I类四聚体（H-2DB/NP34），来自甲型病毒A/Pr/8/34的核蛋白的NP34肽（NP366-374，ASNENMETM）的NP34肽（NP366-374，ASNENMETM）。为了分类实验，使用Live/Dead Marker DAPI（Biolegend，20 ng ML -1）排除了死细胞。对于转录因子或组蛋白修饰的细胞内染色，根据制造商的说明，使用细胞内固定和通透性试剂盒（EBIOSCIENCE）固定细胞并染色。为了染色H3K27AC，用原代兔抗H3K27AC抗体（ABCAM，1：400）染色细胞，然后用次级山羊抗兔AF647（Invitrogen，1：1,000）染色。为了进行细胞因子分析，将T细胞用含有Brefeldin A的细胞激活鸡尾酒（Biolegend）重新刺激4小时。为了对髓样细胞的细胞因子分析，仅将细胞与Brefeldin A孵育4小时。使用Diva软件（BD）对LSR Fortessa（BD）或Aria III（BD）进行流式细胞仪分析，并用FlowJo（Tree Star）进行分析。通过以下方式鉴定细胞：CD4+T细胞为CD45+TCRB+CD4+，CD8+T细胞为CD45+TCRB+CD8+，B细胞为CD45+CD19+TCRB-，嗜酸性粒细胞为CD45+CD11C-CD11C-CD11B+CD11B+SSC-F+SSC-F+ssc-ly-ly-cd11111肺CDC1为Siglec-F-MHCII+CD11C+XCR1+，肺CDC2作为Siglec-F-MHCII+CD11C+CD11C+XCR1-CD11B+CD64-，肺CD64+DC作为SIGLEC-F-F-MHCII+CD11C+CD11C+XCR1-CDCD11B+cdccd11b+cdcr1-cdcd as siglec-f-cd64+dlnCD45+autofluorescent−CD11c+MHCIIhighXCR1+, lung dLN cDC1 as CD45+autofluorescent−CD11c+MHCIIhighXCR1−CD11b+CD64−, Ly-6Chigh monocytes as Siglec-F−Ly-6G−CD11b+Ly-6Chigh and Ly-6Clow monocytes assiglec-f-ly-6g-cd11b+ly-6clow。

　　使用上述组织制备方案从WT小鼠中分离出肺直流。建立单细胞悬浮液后，将细胞用抗MHCII珠（Miltenyi）在冰上孵育1小时，并使用LS MACS柱（Miltenyi）收集富集的馏分。然后对细胞进行染色，并对CDC1和CDC2进行排序。然后将DC在RPMI 1640（不含葡萄糖）中孵育20％胎儿小腿血清，谷氨酰胺，肝素，青霉素/链霉素和低（10 mm）或高（50 mm）或高（50 mm）的葡萄糖，持续20 h，持续20 h，然后在分析或替换为新鲜的低葡萄糖培养基和添加T细胞之前（见下）。在指示的情况下，加入了2-DG（5 mm； Sigma），BMS303141（10 mm; Sigma）或ANA（20 mm; Sigma）。

　　Cells were seeded at 1 × 105 cells per well in an Xfe96 analyser (Agilent) and ECAR or oxygen consumption rate was measured over 80 min with the addition of 10 mM glu​​cose, 1 µM oligomycin and 50 mM 2-DG (for ECAR) and 1 µM oligomycin, 1 µM carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone and在指定的时间点处于0.5 µm放线霉素和烤面包酮。

　　将细胞（1-2×105）在RPMI培养基（生物产业，第01-101-1 A号）中孵育，透析FBS（GIBCO），4 mM谷氨酰胺和11 mM U-13C6-葡萄糖（Cambridge Isotope Laboratories，no。1396）持续6 h。在每个时间点，将22 µL的培养基短暂离心，以去除液氮中的细胞碎片和折射。用400 µL冰冷的80:20甲醇从每个时间点提取培养基（20 µL）：以2 µg ml-1核糖醇作为内标（提取溶剂），涡旋，并在4°C下以18,000g的速度离心15分钟。收集上清液并通过真空（速度VAC和冻干剂）干燥。Dried samples were incubated with 20 µl of methoxyamine hydrochloride (Alfa Aesar, no. A19188; 20 mg ml−1 in pyridine) at 37 °C for 90 min with shaking, followed by incubation with 35 µl of N, O-bis trimethylsilyl trifluoroacetamide (Sigma, no. 15222) at37°C持续30分钟。使用气相色谱仪编号进行气相色谱 - 质谱。7820AN（Agilent Technologies）与质谱仪连接。5975（Agilent Technologies），具有HP-5MS毛细管列30 m 250 mm 0.25 mm（第19091S-433号，Agilent Technologies）。氦载体气体以1.0 mL min -1的恒定速率流动。气相色谱柱温度通过4°C min -1的坡道从70到150°C进行了编程，从250到215°C，通过9°C min -1的坡道从215到300°C，通过25°C min -1的坡道，并在300°C下保持5 min。通过电子冲击电离进行质谱法，并以30至500 m/z的全扫描模式运行。入口和质谱仪的传递线温度为280°C，离子源温度为250°C。样品注入（1 µL）处于分裂模式。使用Masshunter软件（Agilent Technologies）分析了从气相色谱 - 质谱法获得的原始数据信号。使用ISOCOR软件33校正了乳酸的同位素分布。

　　动物被静脉注射五脑棕褐色和冷PBS灌注的肺实施。随后，通过气管导管注入1 ml 5 mg ml -1的剂量溶液（Sigma）。将溶液孵育5分钟，然后切除肺并将其放入冰上IMDM（Gibco）中。然后将肺切碎并与含有1 mg Ml -1 DNase I（Sigma），2 mg Ml -1胶原酶IV（Worthington）和5 mg ML -1配置酶（Sigma）的酶混合物孵育20分钟，在37°C的振动器中20分钟。然后将消化的提取物转移到70 µm的细胞滤网中，并用20 mL PBS粉碎以获得单细胞悬浮液。将细胞在4°C下离心10分钟500克。将沉淀重悬于1 mL的ACK缓冲液中（Gibco，No。A1049201），并在室温下孵育1分钟，然后添加14 mL PBS，然后在500G下离心7分钟。将细胞在冰上在500 µL死细胞耗尽试剂珠（Miltenyi）中孵育1小时，然后将5.5 mL的套件缓冲液添加到每个样品中。将样品过滤并加载到LS柱（Miltenyi）上，并收集了流动。对于使用富含DC的细胞级分的实验，在珠子孵育步骤中添加了50 µL CD19和CD90微粒。将流液在500G处离心7分钟，并在PBS中重悬于BSA 0.04％的PBS中，以直接用于SCRNA-SEQ的样品。对于每个样品，将单细胞悬浮液加载到铬上，瞄准了6,000个细胞。根据10倍基因组学铬单细胞3'试剂盒用户指南（V.3 Chemistry）制备库。在每个实验中，对WT和Akita小鼠都进行了测序，以避免批处理效果混淆。使用Illumina NextSeq 550或Novaseq 6000进行了对库进行测序。在NextSeq上，根据指南对库进行了测序，只是在Novaseq R2上对R2和89进行了56个碱基对。

　　对于SCRNA-SEQ实验，将细胞与1 µg ML-1抗CD16/32（Biolegend）（Biolegend）（Biolegend）孵育5分钟，以阻止FC受体，然后再添加包括哈希抗体的抗体混合物。将细胞在冰上孵育30分钟，加入10 mL的PBS，然后在500G下离心7分钟。除去上清液，并将细胞重悬于PBS中，通过40 µM网格过滤，并按流式细胞仪排序，如上所述。在500G处将分选细胞离心7分钟，重悬于BSA为0.04％的PBS中，并在发送SCRNA-SEQ之前对数进行计数。对于每个样品，将单细胞悬浮液加载到铬上，并如上所述制备。使用哈希抗体（Biolegend totalSeq B0303，B0304，B0305和B0306），我们每个样品组合了两只对照和两只经STZ处理的小鼠。根据10倍基因组铬单细胞3'试剂盒用户指南（v.3.1 Chemistry）制备转录组和标签的测序库。随后，在Novaseq 6000上对库进行了测序，其中89个基对R2。

　　为了进行分析，将BCL文件解散并使用BCL2FASTQ v.2.2.20.0.422（CellRanger Pipeline v.6.0.0中的MKFASTQ函数）转换为FASTQ文件。在使用Akita小鼠的实验中，将Novaseq的读取到56个碱基对，并具有三型v.0.36的基础，该底部对NextSeq进行了测序，以确保样品之间的可比性。随后，将读数映射到小鼠基因组（MM10）与流感A基因组（Puerto Rico 1934，H1N1）相结合，并使用CellRanger Pipeline v.6.0.0中的唯一分子标识符函数对基因表达进行了定量。对于Akita实验，将26个样品（四天0 akita，四天0 wt，五天1 akita，五天1 wt，四天10 akita和四天10 wt）与CellRanger Pipeline中的AGGR功能聚合。通过将单细胞数据的细胞类型频率乘以总肺部计数来获得特定种群的细胞数。对于STZ，也聚集了两个具有四个哈希样品的单细胞库。

　　首先，除去了少于600个转录本的细胞，少于200个检测到的基因和超过20％的线粒体读数被去除。通过找到同时显示两种细胞类型的基因表达模式的细胞簇来鉴定双线，并去除。然后，使用归一化函数的对数正态化方法进行标准化，并使用“ VST”方法鉴定了2,000个高度可变的基因。我们使用高度可变的基因计算了主成分分析，并使用前30个主要组件计算数据集的K-Nearest邻居。最后，使用共享的基于基于基于的基于共享的模块化模块化算法将细胞聚类。上面提到的所有功能是Seurat v.4.0.1包装中的一部分，R34,35中。为了获得更好的聚类结果，我们使用了逐步方法，并根据其标记物将所获得的簇划分为五个数据集，其中包含免疫细胞，上皮细胞，内皮细胞，基质细胞和表达高水平的细胞周期基因的细胞。对于每个子集，可变基因，主成分分析，聚类和UMAP被重新计算。重簇后，由于免疫细胞具有显着的异质性 - 我们决定进一步细分为T细胞，B细胞，单核吞噬细胞以及其余的免疫细胞分数（中性粒细胞和粒细胞）。由于我们对DC特别感兴趣，因此再次将单核吞噬细胞细分为单核细胞/巨噬细胞和DC。所有这些集群使用IMMGEN DATAbase36注释，并先前发布的数据36,37,38,39。为了进行分析，去除了少于300个基因且线粒体读数超过20％的细胞。污染物细胞（主要是NK和B细胞） 通过找到表达DC以外的细胞类型的基因表达模式的细胞簇来识别，然后去除。量化的主题标签被用来解开型号样品 - 我们将主题标签视为单个主题标签，如果特定的条形码丰度高于第二多数的五倍。尚未鉴定出主题标签的细胞，或者如果发现了一个以上的主题标签。然后如上所述对Akita小鼠进行标准化，缩放和聚集的数据。我们将整个肺部的单细胞转录组数据用作细胞类型注释的参考。使用DESEQ2（参考文献40），在每个样品中的每种单元类型中对条件之间的差异表达分析进行。使用具有默认设置的G：Profiler2进行差异表达基因的功能分析，并根据调整后的P值进行排序，并使用所有鼠标基因作为背景控制41进行了默认设置和多个假设测试调整。log10 false发现率调整后的P值被绘制为小花。对于热图，基因本体论列表是从Ensembl Biomart获得的。使用标准设置的Gprofiler2 r包装，使用PBS对照中的所有差异表达基因进行的所有差异表达的基因进行的所有差异表达的基因进行。

　　H3K27三甲基化（H3K27ME3）和H3K27AC使用修改后的剪切和运行协议从排序的DC进行了介绍。从200,000个排序细胞中提取细胞核。Cells were collected by centrifugation at 500g for 5 min at 4 °C and gently resuspended in 50 µl of lysis buffer containing 10 mM Tris pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1% BSA, 0.1% Tween-20, 0.1% IGEPAL, 0.01% Digitonin (Promega), 1 mM DTT and 1× complete protease inhibitor with在冰上孵育3分钟。添加了含有10 mM Tris pH 7.4、10 mM NaCl，3 mM MGCL2、1％BSA的洗涤缓冲液（50 µL），添加了0.1％Tween-20、1 mM DTT和1×Complete蛋白酶抑制剂。通过在4°C下离心500克5分钟收集核，并重悬于100 µL的室温NE缓冲液中。通过用100 µL 10 µL -1冷珠激活缓冲液（20 mM HEPES pH 7.9，10 mM KCl，1 mM CaCl2，1 mM Cacl2，1 mM MM MNCL2）用100 µL -1冷珠活化缓冲液洗涤两次，通过两次洗涤珠子两次洗涤珠珠A珠（每个样品5 µL； Epicypher）。将珠重悬于每个样品冷珠活化缓冲液中10 µL中。将细胞核与乳甘藻蛋白珠在室温下孵育10分钟。将珠放在磁铁上，除去上清液，然后将核重悬于50 µL冷水缓冲液中（20 mm HEPES pH 7.5，150 mm NaCl，0.5 mm精子，1倍完整的蛋白酶抑制剂，2 mm EDTA）。原代抗体（0.5 µl H3K27ME3抗体，NO。C36B11，细胞信号传导； H3K27AC抗体，NO。D5E4，细胞信号传导；同类型对照抗体，NO。DA1E，细胞信号传导），将其添加到每个样品中，并在4°C下在营养师处孵育过夜。Beads were placed on the magnet, supernatant was removed and nuclei were resuspended in 50 µl of digitonin buffer (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidine, 1×  complete protease inhibitor, 0.01% digitonin, 2 mM EDTA) and 0.5 µg of anti-rabbit secondary antibody, Epicypher was added, mixed并在室温下孵育30分钟。当珠子在磁铁上时， 将它们用200 µl冷数字蛋白缓冲液洗涤两次，然后重悬于50 µL高盐的高盐蛋白缓冲液中（20毫米HEPES pH 7.5，300 mm NaCl，0.5 mm bermidine，0.5 mm bermidine，1×完整的蛋白酶抑制剂，0.01％digitonin，2 mm Edta）;然后将2.5 µL的PAG-TN5（Epicypher）添加到每个样品中，然后在室温下进行涡旋和孵育1小时。将核用高盐数字蛋白缓冲液洗涤两次，并加入50 µL冷标记缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，300 mm NaCl，10 mM MGCL2，0.5 mm bermidine，1×Complete蛋白酶抑制剂），然后在37°C下孵育1 h。标记后，将核用50 µL的10 mM N- [Tris（羟甲基）甲基] -3-氨基丙磺酸（TAPS）pH 8.5和0.2 mM EDTA洗涤。为了释放DNA片段，将5 µl的10 mM TAP pH 8.5用0.1％SDS添加到58°C下孵育1小时的核中。随后，添加15 µL的0.67％Triton-X以中和SD。在20 µl样品中，在58°C下58°C孵育58°C，在58°C的58°C下孵育5分钟，在98°C下，在98°C下，在98°C的98°C下，在58°C的72°C下，在58°C的72°C下，在58°C的58°C下孵育25 µl 2×PCR主混合物和2 µl每个引物i5和i7（Illumina）的2 µl，并在98°C下进行18秒，并在98 s°C下进行。72°C持续1分钟。根据制造商的建议，使用1.3×Ampure珠清洁库，并在15 µL的TE缓冲液中洗脱。

　　为了进行分析，将BCL文件解散并使用BCL2FASTQ v.2.20.0.422转换为FastQ文件。随后，将读取用于使用标准参数的FastP V.0.23.0删除适配器。使用Bowtie2 v.2.3.5.1和以下参数进行映射到GRCM38基因组： - 本地 - 非常敏感的本地 - 毫无本地 - 无 - 无 - 不混合-no-discordant -phred33 -i 10 -X 700，并用Picard v.2.22.8（参考。用Samtools v.1.9和BedTools v.2.26.0转换文件以生成床段文件43。使用同种型控制数据作为背景，使用SEACR v.1.3调用峰，从而识别最接近峰值的基因44。将数据子采样以相同的样品覆盖范围，并用Bedtools Multicov43对峰值进行读数。为了找到差异丰富的峰，我们使用了deseq2（参考文献40）。

　　CDC1和CDC2从WT或Akita小鼠的幼稚肺中分选。CD8+ T细胞是从T细胞受体转基因OT-I小鼠的脾细胞获得的，其中所有CD8+ T细胞都识别OVA的siinfekl肽。使用CD90.2 MACS-珠（Miltenyi）富集和随后的基于流式细胞仪的CD8+CD11C- aufluorescent-neggation-licgation-licgation细胞进行分离。然后将T细胞和DC在具有100 mg ML -1 OVA蛋白的完整IMDM培养基（生命技术）中共培养4天。

　　小鼠在第0天接受10μg的HDM在50 µL PBS（CITEQ）中接受敏化，然后在第7-11天使用10μg的HDM挑战，并在第14天进行分析。

　　感染后24小时24小时，气管内给小鼠施用200μgHDM。对肺直流进行分类，并在气管内转移到幼稚的WT受体中。每只鼠标收到5×105个单元。然后在第7-11天用10μg的HDM每天对动物进行挑战，分析在第14天进行。

　　PR8流感病毒在紫外线灯下灭活30分钟。在感染后感染后，将小鼠在气管内给药2.5×106菌斑形成的单位（PFU）灭活PR8 20小时。肺直流分类并转移到每个受体3×105个细胞的幼稚接受者中。10天后，将动物感染500 PFU PR8，并在感染后7天安乐死。

　　动物的气管内接受了200μg卵蛋白 - 脂蛋白-Alexafluor647（Invitrogen）和100μgHDM（CiteQ）或500 PFU PR8。在指定的时间点收集肺和DLN。

　　1天后，用9.5 Gy对WT受体进行了辐照，并用ZBTB46-DTR骨髓移植。骨髓重建后8周使用动物进行实验。在相关组中，动物每隔一天每隔一天接受20毫克的体重白喉毒素，持续10天。

　　使用Bruker Minispec LF50/MQ7.5 MHz活鼠分析仪使用核磁共振测量游离流体。

　　去除肺并将其固定在4％甲醛中。对组织进行处理并用血久蛋白和曙红染色。根据炎症的严重程度（炎症评分），通过认证的病理学家评分对肺部评估肺。

　　将细胞裂解在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中，在4°C下孵育30分钟，并在4°C下以15,000g离心10分钟。样品在12％的丙烯酰胺凝胶上运行，并转移至硝酸纤维素膜。使用抗H3K27AC多克隆抗体（No。AB4729，1：1,000; ABCAM），β-肌动蛋白（No。MA5-15739，1：1,000，Thermo，Thermo），山羊抗小鼠HRP（编号115-035-205-205，1：1：5,000，杰克逊犬）进行免疫印迹分析。111-035-003，1：5,000，杰克逊实验室）。使用GEL DOC XR+系统（Bio-Rad）进行免疫印迹成像和带强度定量。

　　在Trizol（Bio-Lab）中收集肺叶，冷冻在干冰上，并保存在-80°C下，直到RNA分离需要。为了分离RNA，将样品解冻，加入金属珠，并在30 Hz中将细胞裂解在组织念珠剂（Qiagen）中2分钟。接下来，加入200 µL氯仿，并在4°C下以13,000 rpm离心15分钟。将透明层转移到新的管中，加入500 µL的异丙醇，并在-20°C下沉淀过过夜。将样品在4°C下以10,000 rpm的速度离心8分钟，并在乙醇中洗涤一次颗粒，并重悬于50 µL的DNase Digestion Mix（Sigma）中。根据制造商的说明对样品进行处理。随后使用高容量逆转录试剂盒（Applied Biosystems）对1 µg RNA进行逆转录。对于宿主和病毒基因的定量PCR，将DNA模板稀释以每反应获得1 µg。使用以下底漆集进行扩增：PR8向前，5'-agatgagtcttctaaccgagggtcg-3';PR8反向，5'-TGCAAAAAACATCTTCAAGTCTCTG-3';PVM前进，5'-gcactctgccagatggttg-3';PVM反向，5'Cagggaaactcaaagggtca-3';hprt向前，5'-tcagtcaAcgggggggaCataAa-3';HPRT反向，5'-GGGGGTGCTGCTGCTTAACCAG-3';IFNB1向前，5'-TCCGAGCAGAGATCTTCAGGAA-3';IFNB1反向，5'-TGCAACCACCACTCATTCATTGAG-3'。快速SYBR Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific）用于重复项。扩增条件如下：在95°C下变性20 s，然后是40个变性95°C的循环。在60°C下退火20 s，然后进行熔融曲线。使用∆CT方法分析数据。

　　将细胞分类为100％甲醇，以获得60％甲醇的最终浓度并在液氮中冷冻。使用SpeedVac蒸发缓冲液，并将其存储在-80°C下直至进一步处理。对于液相色谱 - 潮流质谱法（LC – MS/MS），在冰上解冻样品，并在4°C和13,000g的冰上融化10分钟。将上清液转移到新的试管中，在LC-MS级水中冻干并重构。使用Shimadzu UHPLC系统（HSS T3，3.5 µm粒径，100Å孔径，100×2.1 mm2）进行色谱。注射体积为20μl，将烤箱温度保持在40°C，并在5°C下保持自动采样器温度。使用线性梯度程序以恒定的流速（350 µL min -1）在总运行时间为7分钟，从83％到5％溶剂A（水pH 9.0中的10 mM乙酸铵）在7分钟内实现色谱分离。甲醇：水（1：1）在每个注射周期之前用来洗涤针。所有样品均以两份分析。使用AB Sciex Triple Quad 5500质谱仪在负离子模式下检测到乙酰辅酶A，具有电喷雾电离和采集的多反应监测模式。离子涡轮增压V源温度设置为450°C，离子喷射电压为5,000V。将窗帘气体设置为30.0 psi。雾化剂气体（气体1）设置为50 psi，涡轮加热器气体（气体2）设置为50 psi，碰撞气体设置为高，停留时间为20 ms。监测了两个过渡：M/Z 303.1（量词）和M/Z 428（限定器）。使用Analyst 1.7.1进行数据采集，并使用SCIEX OS软件分析数据。

　　用100 µL的80％甲醇裂解细胞并提取两次。在4°C的离心机中将不溶性材料沉淀。收集并蒸发上清液。如前所述45，将残基重悬于100 µL水中，用于通过衍生化进行LC -MS/MS分析。简而言之，在75％甲醇中，将100 µL的标准或样品与50μl的35 mm 3-硝基苯基氢嗪（Sigma）混合在一起，在甲醇和50％的甲醇中，50μl105 mm N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二苯二酰胺（SIGMA）中的2.5％peyrice。在4°C摇动反应混合物30分钟，然后蒸发。将残留物重悬于50μl的100％甲醇中，过滤并用于LC -MS/MS分析。LC – MS/MS仪器包括I-Class UPLC系统（WATERS）和XEVO TQ-S三倍四极杆质谱仪（Waters），配备电喷雾离子源并在负离子模式下运行。MassLynx和Targetlynx软件（V.4.2，Waters）用于获取和分析数据。在150×2.1-mm2内直径，1.8μmUPLC HSS T3柱（Waters Acerity）上进行色谱分离，其移动阶段A（0.03％甲酸水溶液）和B（0.03％的BOMIC AIRIC ACETIC）和BOR（乙腈中的0.03％甲酸），流量为0.3 ml min -1 min -1和柱温度为40°C的流量。所使用的梯度如下：在前1.5分钟内，将色谱柱保持在5％B，然后将线性增加到73％B，然后在接下来的30 s到90％B中，然后在35.5-38.0分钟内回到5％B，并在5％B处平衡7分钟。将维持在4°C的样品自动注入5μL的体积。对于MS，氩气被用作0.10 mL min -1的流动碰撞气体。毛细管电压设置为2.23 kV，源温度为150°C，脱溶剂温度为400°C，锥体气体流量为150 L H -1，脱溶性气流为800 L H -1。丙酮酸的多反应监测过渡如下：357.2（12C），358.2（13C1），359.2（13C2）和360.2（13C3） M/z用于母子离子，碎片离子为136.9 m/z，碰撞能量为15 eV。

　　使用了渗透微型泵（Alzet，型号2004）（以0.25 µl H -1的速率注入化合物28天）。泵中填充了在PBS（-ca2+，-mg2+）中稀释的200 µL人类胰岛素（Sigma）。车辆控制泵包含等效体积的PBS（-ca2+，-mg2+）。通过腹膜内注射氯胺酮（100 mg kg -1）和甲基嗪（10 mg kg -1）来麻醉小鼠。颈部的皮肤被剃光并用70％乙醇消毒。在最小的解剖后，在皮肤和渗透泵上插入的渗透泵上切开了一个切口，并将其放在右后侧。用无菌手术夹封闭切口，经常监测小鼠的压力，出血，疼痛，排出或异常行为的任何迹象。

　　在指定的持续时间内，每天在100 µL玉米油（Sigma）中接受5 mg kg -1 ana（Sigma）。

　　小鼠在静脉内接受了100μl的5 mm 2-NBDG（热渔民科学），并在30分钟后安乐死。

　　在指定的持续时间内，小鼠在200 µL PBS腹膜内接受了240 mg kg-1 2-DG（Sigma）。

　　将血液样品在4°C和12,000克离心15分钟，以将血浆与细胞分离。根据制造商的说明，使用Roche Cobas 111血清分析仪测量酶活性和分子浓度。

　　根据制造商的说明，使用超敏感小鼠ELISA试剂盒（Crystal Chem）测量血浆胰岛素。

　　使用GraphPad Prism 9.2和R进行了统计测试，以汇总不同独立重复的结果，所有来自同一实验组的小鼠均进行了合并，并对整个汇总实验进行了新的统计比较，并对单个重复进行。所有测量均取自不同的样品。对于所有数据集，使用Shapiro-Wilk测试计算正态性，并相应地使用了参数或非参数测试。为了进行正态分布的两组之间的比较，进行了双面未配对的t检验。为了比较两个非正态分布的组，使用了两侧的Mann-Whitney U检验。为了比较两组以上的比较，使用HOLM-SIDAK进行参数分布的数据集和Kruskal-Wallis测试，并使用Dunn对非参数分配的数据集进行了多次比较，以进行多次比较。所有精确的p值均在补充表1中。p <0.05被认为是重要的。*p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001。所有实验在两次至七次之间重复。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。