哺乳动物细胞中细胞器之间接触的最普遍位点在内质网（ER）和线粒体9,10之间。该界面与健康和疾病的多种生物学过程有关，范围从脂质合成和分解代谢到钙信号传导以及细胞呼吸的促进2，3,11。这些结构通常称为ER-明膜软骨接触位点（ERMCS）或线粒​​体接触位点（MERCS），这些结构在真核生物中无处不在，可能以几种不同的形式存在（请参阅补充文本，第2A – B节，以进行全面讨论）3,4,6,6,12。然而，技术局限性限制了我们对ERMC生物学许多方面的理解，因为这些结构对固定人工制品非常敏感，即使在单个细胞中也表现出显着的生物异质性。结果，基于生物化学的方法通常会遭受平均人工制品的困扰，并且大多数现有的标签技术对ERMCS的大小，结构和调节都扰动（请参阅补充文本，第1节和第2节，进行讨论）7。特别是，我们缺乏对它们的分子成分和子结构的动态调节的理解。在这里，我们介绍了将三维（3D）电子显微镜和活细胞，高速单分子成像结合在一起的定量成像方法，以描述不同生理和病理条件下ERMCS中分子的子结构和动力学。

　　ER和线粒体之间的特定接触位点是通过成对的分子系tether介导的（图1A）1,5,6。一个完善的ERMC束缚是ER定位的囊泡相关的膜蛋白（VAMP）相关蛋白B（VAPB）13,14,15，它与线粒体结合伴侣相互作用，可促进钙和脂质转移16,17，并造成型号neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron neuron18,18,18,18,18,18,18。线粒体中VAPB的最佳特征结合伴侣是线粒体外膜（OMM）成分，蛋白酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51（PTPIP51）14,16,20。为了可视化ERMCS的3D结构，其中VAPB和PTPIP51可能会相互作用，我们使用了高压冻结，然后使用冻结固定和聚焦的离子光束扫描电子显微镜（FIB-SEM）21。这种方法保留了其接近本地状态8的接触站点，避免了可能破坏其精致组织的化学固定伪像22,23,24（补充文本，第3A节）。手动重建了来自几个COS7细胞的小体积中的ER和线粒体。我们将接触位点确定为OMM 24 nm内的ER膜区域，即VAPB12,20的束缚距离（图1B，扩展数据图1A – C和补充视频1；有关详细信息，请参见方法和补充文本，第3B节）。ERMCS在FIB-SEM体积中高度丰富，通常出现在线粒体Cristae的底部附近（图1C和扩展数据图1C）或OMM中的收缩区（扩展数据图1B）。这些位点的放置与ERMCS在线粒体能量产生和线粒体裂缝中的已知作用一致。25,26,27。

　　接下来，我们试图在活细胞的动态环境中在分子水平上表征ERMCS。单个粒子跟踪 - 激活定位显微镜（SPTPALM）28用于跟随单个VAPB分子的运动，同时同时捕获ER的位置，这是将形成轨迹的人工制成的必要要求（补充视频2和补充文本，第6Aa – b）。通过遗传融合将其融合到Halotag并使用可将光活化版本的JF646（参考文献29）标记，可以看到该系统中VAPB和其他蛋白质的单个分子，以非常低的效率将其标记，以确保将单个蛋白质正确地传播，以最小的链接Artefacts跟踪单个蛋白质（图1D和补充视频）。

　　为了解释分子运动的模式，我们首先使用了与接触位点不关联的探针，该探针用最小的尾锚（Halotag-ta）与Halotag靶向ER。我们发现它随机探索了ER的表面，对任何特定的ER区域都没有可检测到的偏好（图1E，尾锚）。相比之下，当我们跟踪VAPB时，我们观察到高度空间相关的轨迹的簇（图1E，VAPB，请参见黑色箭头）。通过将特定时间窗口中的所有轨迹转换为空间定义的概率函数（方法），在空间相关的轨迹的位置以ER区域的形式出现，具有VAPB定位的概率升高（图1F）。这些概率“热点”存在于VAPB数据集中，但不与Halo-TA（图1F）（图1F），并且与从FIB-SEM体积中提取的ERMCS的大小一致，当以类似的空间分辨率进行分析时（图1G-I和扩展数据时，请参见图1D，请参见图1D，请参阅方法，了解更多详细信息）。

　　ER和线粒体与SPTPALM结合的同时成像证实，大多数VAPB热点位于接近线粒体附近的ER区域（图1J和补充视频2），与热点相符，与Er -​​Mitsochoctria肌的增加相一致。值得注意的是，由于VAPB已知作为附加细胞器的系绳作用，因此在附近没有线粒体的ER区域也发生了一些概率热点（图1J，箭头和扩展数据图2）。VAPB热点的形成完全取决于蛋白质通过其N末端胞质结构域结合其相互作用伴侣的能力。该N末端结构域的截断废除了热点形成，相反，N末端结构域与ER靶向的TA对照的融合足以形成热点（图1K-M）。因此，我们得出的结论是，线粒体上与VAPB相关的热点代表了真正的ERMCSS的系绳相互作用。

　　除了提供活细胞中ERMCS的超级分辨图像外，我们的基于SPTPALM的方法还可以分析单个VAPB分子如何随着时间的推移与ERMC相互作用。值得注意的是，并非所有遇到接触位点的VAPB分子都表现出直接参与度，即使在单个单元格中，ERMCSS之间的参与可能性也很大（扩展数据图3A – E）。值得注意的是，订婚的VAPB分子仅在接触位点中很短，大多数分子以毫秒的时间尺度离开位点（图2A – D和补充视频3，中间停留时间= 556毫秒）。这种动态交换的速度几乎是与质膜接触位点的分子报道的速度（补充文本，第2C – D节），强调了该界面上VAPB和其他分子的快速重排。

　　为了更定量地了解这些瞬态相互作用，我们利用了非参数贝叶斯方法30。足够长的轨迹（大于500步，约5.5 s）被分成段，估计代表不同的动力学状态31（补充文本，第6d – e节）。这允许分类在ER中自由扩散（蓝色）或接触站点相关（红色）（图2E，F和扩展数据图4A – C）。当在多个细胞中的许多接触位点进行分析时，我们发现ERMCS中的单个VAPB分子相对于周围ER小管中的VAPB分子显示出显着降低的扩散（DEFF）（图2G）。同时，与固定的珠子对照相比，ERMCS中的VAPB分子保留了扩散运动的特征（图2H；请参见补充文本，第6D -E节，有关详细信息），以获取详细信息），表明在接触站点内仍在接触位点内进行动态运动，请参阅第2节，请参阅第2节，请参阅第2节。

　　尽管某些ERMCS在实验过程中移动或短暂寿命（少于1分钟）（扩展数据图5），但在60-90 s的成像中，大多数仍然保持稳定。在此期间，许多单独的VAPB分子反复探索了相同的接触站点接口。为了绘制该界面处的扩散景观，我们将接触位点分为小区域，并分析了每个社区内轨迹段的平均扩散（扩展数据图6A – F和补充文本，第6C节）32,33。在研究数据集中每个稳定的接触站点中VAPB的扩散行为，我们在VAPB扩散景观中发现了一致的模式。检查的每个接触地点共享一个低扩散的中央子域，该子域逐渐返回到接触位点边缘的周围ER的扩散景观（图2i – k）。这种低扩散子域的位置和形状与找到VAPB分子的可能性密切相关（图2K），表明在中央亚域中扩散​​速度放缓的位点也升高了链纤维丰度。这表明，富含VAPB的中央子域，其中VAPB系绳浓度最高，可以代表接触部位的区域，在该区域中，粘合力最大。

　　为了确定ER和线粒体之间是否存在增加的粘附区域，如果是这样，它们在整个接触位点的分布是什么，我们在FIB-SEM数据集中检查了ERMCSS。在每个接触位点检查ER的局部曲率（补充文本，第3D – E节）时，我们发现ER膜在其中心有一个不同的净负曲率区域（图2L，M，箭头）。在ERMC的这个核心区域中，ER采用了与之结合的线粒体的逆形。这表明该区域中的粘合剂束缚足以使ER膜从其正常的高度阳性平均弯曲度变形（扩展数据图7A – F）。

　　为了解决这些负局部ER曲率的这些区域是否与上述VAPB低扩散子域相关，我们将沿简单管状ER结构定位的所有SPTPALM检测的接触位点对齐到刚进入的ER管的方向（如纤维 - 纤维SEM的扩展数据图7所做的那样）。这些接触位点的总概率密度增加了分辨率，并表明VAPB强度的不同峰具有明显的概率肩部，伸向周围的ER小管（图2N，红色和灰色条，以及扩展的数据图6G）。从FIB-SEM数据集中，这种产生的概率分布与接触位点内的负/正曲率区域的模式非常相似（图2M）。因此，VAPB分子扩散的结构FIB-SEM数据和模式都支持ERMCS中的中央子域的存在，ERMCS中具有较高的VAPB丰度和更大的粘附特性。VAPB扩散和链球丰度移动到中心域的逐渐变化表明接触位点可能是亚稳态界面。在该模型中，ERMCS将以许多瞬时结合事件为特征，其可能性逐渐增加向中心域，与上面观察到的快速链球交换一致（图2A – D）。这样的模型将预测接触位点中的粘合性绑扎力可能不会均匀地散布在整个结构中，而是优先富集在中央子域中，从而导致观察到的负曲率。

　　为了了解如何调节ERMCS的整体规模，我们检查了ERMCS的大小依赖性对相关的绑定伙伴的可用性。我们在COS7细胞中瞬时过表达的PTPIP51（图3A），并进行了SPTPALM实验。与未表达PTPIP51的对照细胞相比，接触位点的大小显着增加并覆盖了线粒体的大部分（图3B）。ERMCS扩展发生在结构的两个轴上（图3C，D）。为了测试接触位点的扩展是否同样依赖于束缚对的两个成员，我们将COS7细胞中的ER和线粒体标记为ER和线粒体，并过表达VAPB或PITPIP51，通过Airyscan Imaging评估ER和线粒体形态。在测定的时间点，ER和线粒体形态对VAPB的过度表达不敏感，但是PTPIP51过表达时存在巨大的重排，现在ER现在完全包围了大多数线粒体（图3E）。尽管进行了戏剧性的结构重排，但对SPTPALM数据的分析显示，每个单元的接触位点总数没有增加。但是，几乎所有与线粒体以外的细胞器相关的VAPB接触位点的损失，并且随时在VAPB的比例上均显着富集线粒体（图3F）。这表明，在这种情况下，线粒体处的VAPB结合远远超出了其在非单位方面相关位点的潜在相互作用。一致，高度表达VAPB和PTPIP51的细胞基本上完全耗尽了VAPB的ER库，而蛋白质则在扩展的接触位点富集（图3G）。因此，线粒体tethers的可用性控制着ER和线粒体之间的VAPB介导的束缚。

　　接下来，我们探讨了ERMC的结构和动力学如何适应满足细胞需求的生理挑战。先前的生化和冷冻EM研究表明，在急性养分剥夺期间，ERMCS扩展和改变组成11,34,35,36,37。提出这些变化是为了提供至关重要的脂质和钙至线粒体以燃料氧化磷酸化或刺激凋亡38,39。为了调查这种扩展及其对联系站点子结构的影响，我们采用了SPTPALM方法。VAPB轨迹用于测量8小时急性营养剥夺后COS7细胞中接触位点的大小和组织，通过培养汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中的细胞来实现。观察到接触位点的大小显着膨胀（图3H – J）。映射VAPB在饥饿细胞内接触位点的扩散景观，我们观察到，尽管它们的尺寸和形状扩大，但它们仍然包含一个单个中央低扩散子域（图3K，L和扩展数据图8A – C）。然而，尽管持续与ERMCS和与其他细胞器的接触位点相互作用，但中央子域内VAPB的有效扩散系数显着低于在喂养细胞的接触位点中测量的有效扩散系数（图3L，M和扩展数据图8D，E）。这些结果表明，即使ERMCS在饥饿的细胞中变得更大，它们仍保持动态特性。VAPB分子仍然高度富集在中央亚域，并保留迅速进出接触位点的能力。在饥饿下，ERMC将ERMC的这种动态重塑可能使ER和线粒体能够进行更有效的代谢产物以获得细胞存活。

　　随后，我们检查了引起疾病形式的VAPB是否影响了联系现场组织。编码VAPB的基因中的几个突变是运动神经元疾病肌萎缩性侧索硬化症（ALS）18是病因。在患者中，ALS与线粒体和相关的氧化应激40,41最明显地相关。引起疾病的VAPB突变通常编码蛋白质的更容易聚集的版本，并赋予疾病作为主要的，高度渗透的等位基因42。聚集的VAPB分子是非功能性的43,44,45,46，并迅速降解47，因此疾病状态已提议通过聚集体的毒性作用或由于聚集的蛋白质降解而导致的基因剂量效应来传达疾病状态。42。然而，另一种可能性是，在固定在聚集体中并最终降解之前，ER靶标的突变体VAPB分子归因于ERMCSS，并引起异常的接触位点动力学和/或功能。

　　为了区分这些可能性，我们跟踪了带有良好特征的ALS8错义突变（p56）的单个VAPB分子的运动，该突变（p56s）在负责线粒体相互作用的MSP域中发现（图4A）14,48。与描述不溶性ER相关骨料的生化研究的结果一致19,43,49，许多P56S VAPB分子以固定的形式（图4B，C，灰色），很少变成其他动态状态。p56s VAPB分子的大量部分也显示出像野生型（WT）VAPB一样的游离ER扩散的特征（图4B，C），表明某些p56s VAPB分子仍在未汇总形式中有效地插入ER中。然而，值得注意的是，额外的p56s vapb分子池显示出与接触位点相关运动的不同特征（图4B，C）。这表明某些p56s VAPB分子仍然到达ERMCS，并提高了p56S VAPB可能会损害ERMCS结构和/或动力学的可能性。

　　为了评估p56s VAPB分子是否影响ERMCS，我们比较了来自WT VAPB或p56s VAPB轨迹的接触位点的特性。尽管含有p56的含有VAPB的接触位点通常看起来与WT VAPB接触站点非常相似，但它们显示出略有但统计学意义的大小增加但有效扩散的减少（扩展数据图9a – d）。然而，纳米级对ERMC子域结构和VAPB动力学的检查发现了惊人的差异。与WT相对的p56s含有VAPB的接触位点通常显示出多种不同的低扩散子域（图4D和扩展数据图9E，F），其中一些完全不与链缆密度相关。因此，这些子域不太可能代表在WT接触位点普遍观察到的亚稳结构。在这里，P56S VAPB分子被困在捕获中，显示了子域内的高度限制，而不是探索整个ERMC（图4E）。因此，在整个轨迹寿命中，ERMC中的p56s VAPB分子的大部分位置保留在ERMC中（图4F），这是它们到达接触位点边缘并从ERMC中逃脱的能力受损的结果。实际上，ERMCS中观察到的p56s VAPB分子的停留时间明显比WT VAPB分子的停留时间长大，这表明p56s VAPB表达会导致ERMCS界面的整体组织和可塑性发生巨大变化。