AE。O. akbari（UCSD）提供了埃及利物浦菌株（LVP），并在这项研究中用作野生型菌株。TRPA11（参考文献17中称为TRPA1 - / - 和TRPA1ECFP），GR191（在参考文献17中称为GR19 - / - 和GR19DSRED）和ORLANDO（ORLANDO）AE。L. Vosshall（洛克菲勒）提供了埃及菌株。TRPA11线耗尽到LVP线五代，并再生一条纯合线。我们之前介绍了OP11，OP12，OP21和OP22菌株，它们的双突变版本（OP11，OP22和OP12，OP21）和这些线条的脱落51。自本出版以来，我们已经采用了新的命名法来命名突变和转基因线。更新和以前的等位基因名称分别为：OP11 = OP1R，OP12 = OP1G，OP21 = OP2R，OP22 = OP2G。an。Stephensi菌株是从O. akbari（UCSD）获得的。每条线的所有蚊子在1-3周龄时都随机分析。我们专门使用女性，因为只有女性显示寻求宿主的行为。

　　在28°C的腔室中饲养蚊子，其相对湿度在14 h – 10 h的光线循环下，相对湿度为80％。将蚊子幼虫在反渗透水中孵化，并使用鱼类食物（四胺热带颗粒，16122，四）饲养。将成年蚊子保持在10％的蔗糖（W/V）溶液上。为了传播蚊子，雌性是在膜喂养系统（SP6W1-3，hemotek）上喂养的，其中含有除纤维的绵羊血（DSB250，止血实验室）。UCSB机构动物护理和使用委员会批准和监视了饲养和维护程序。

　　用于行为测定的竞技场是由UCSB物理机构定制制造的。如图1A所述，对五个0.5英寸丙烯酸（8560K268，MCMASTER-CARR）进行了加工。在一个面板中进行了两个10 cm×10 cm的切口，并具有足够的公差，以牢固地固定两个毛皮板（10 cm×10 cm）（TEC板，TEC板，TCP-50型，高级热电）。使用不锈钢插座头螺钉（McMaster-Carr）组装面板。安装了一个LED灯条，以照亮包含Peltier设备（B07CVCF8JF，Yeezen）的墙壁。

　　竞技场面板的内部面孔除了所有外部面板外，所有的内部面均覆盖着白色PVC粘合剂（接触式，Kittrich）纸，以限制蚊子视野中有害的视觉刺激，并产生高对比度图像（黑暗蚊子身体与轻型背景），以进行后续对象跟踪。毛皮板上还用白色接触纸覆盖（发射率，0.92）。此外，在竞技场壁上嵌入的毛皮设备从竞技场的内部凹入0.5厘米，以提供气隙，以提供气隙（扩展数据图1B）。在剩下清晰的面板后面，我们安装了一个网络摄像头（Logitech C920，Logitech），该网站上训练了装有Peltier板的竞技场墙（扩展数据图1B）。实验是使用Logitech网络摄像头软件（V.2.51）录制的视频。

　　该竞技场的设计可容纳30 cm×30 cm×30 cm蚊子笼（Bugdorm-1，DP1000，Megaview Science），从顶部放置在竞技场内。为了提高成像质量，我们用1/16英寸厚的透明丙烯酸面板（8560K171，McMaster-carr）替换了一个笼子的网格面板（扩展数据图1C），在整个研究中，这些面板被称为测定笼。这种修改使我们能够实现更清晰，更高对比的图像，从而提高了我们的跟踪能力。透明的丙烯酸面板用小机螺母和螺栓（92000A155，91828A220，McMaster-Carr）固定在位。面向毛皮尔热靶的笼子的侧面用细聚丙烯网覆盖，这对IR非常透明。

　　使用12 V电磁螺线管气阀（KL04010，Beduan）构建了自动二氧化碳释放系统，该系统由UNO R3控制器（EL-CB-001，Elegoo）和12 V接力模块（Hiletgo）控制。控制器板使用自定义的Arduino脚本编程，该脚本以预定的间隔打开并关闭了螺线管阀。该二氧化碳通过周围的穿孔管释放在舞台上（扩展数据图1D）。为了测量典型的实验性方案期间的二氧化碳动力学，我们将CO2传感器（CO2米气体测量专家，030-8-0010，K30 FR快速响应10,000 ppm CO2传感器）放在左或右侧直接位于每个区域的左侧或右侧的测定笼内。我们使用Gaslab软件测量了局部CO2浓度5分钟的增加。我们发现，从放置在分析笼内的二氧化碳传感器中记录并暴露于研究中使用的5分钟CO2范式时，绝对二氧化碳浓度范围为500至800 ppm。我们发现左/右CO2浓度没有差异（扩展数据图1E）。该系统允许以实验重复的固定间隔可再现释放CO2。可应要求提供接线示意图和代码。

　　通过擦拭笼子网的整个前表面5-10倍的整个前表面的磨损手套来使用人类气味。由于笼子两侧的表面温度相同（扩展数据图2a），因此由于一侧温度较高而导致的气味挥发性升高并不是问题。在扩展数据中，如上所述，将人类气味应用于前笼网的一半。为了进行这些实验，不使用热IR源（两个毛发均处于29.5°C的环境温度）。

　　除非另有说明，否则将80个雌性蚊子从分组的饲养笼中手动吸出，并在实验前一天放置在改良的实验笼中，在那里允许他们以10％的蔗糖量为食。用于行为实验的蚊子的年龄为1-3周。大多数实验是在主观早晨（Zeitgeber时间1-5）进行的，在此期间，内源性宿主寻求活性很高（补充图1A）。我们使用了大量的蚊子，用于驱动模拟的安滕纳（Mosquitoes），分别是驱散和远端 - 触及式驱逐的组（分别为175和300），以在5-20范围内实现HSIS，因为这些蚊子表现出宿主寻求活性的总体降低。

　　对于单个给定条件，每个笼子（生物重复，n）至少测试了三次（技术重复）。如果重复符合纳入标准，则将它们平均，并使用平均值来计算该笼子的平均响应（n）。如果笼子没有获得两个合适的重复，则该研究未包括在本研究中。对于扩展数据的实验图8a，我们没有使用5个标准为5的标准，因为CO2 +气味比CO2，气味和IR一起引起的HSI弱。

　　为了提供额外的测试以验证从34°C毛皮的对流变暖未达到蚊子笼的表面，我们修改了上述设置（请参阅“进行IR-Preference分析的设置”部分），并添加了从第一个PE层的第二个PE膜2 cm，距离第一个PE层，距离Cage Mesh Mesquitoes Land of cage Mesh shere 2 cm。使用温度探针（TSP01-USB温度和湿度数据记录仪； Thor Labs），在5分钟的时间范围内将温度记录在笼网的表面和第二个PE膜的表面。使用这种改良的设置，使用野生型（LVP）女性进行偏好测定，其中我们将一侧从34°C源暴露于IR，双方暴露于人类气味和5％CO2。

　　为了测试IR在单向选择测定中是否是一种有效的提示，我们修改了设置（请参阅“进行IR-Preference Assays”部分的设置），并使用了具有类似于双向选择实验的对流屏障的单个Peltier设备。在二氧化碳和人类气味的情况下，用野生型（LVP）雌性蚊子（28-37°C）进行了行为测定。在整个5分钟实验中，HSI计算为在与单个毛皮尔装置相反的笼子网的平均数量。

　　为了测定雌性蚊子能够检测到热IR的距离，我们首先考虑到成年人类树干的平均表面积约为0.28平方米。这是基于一个估计，即平均人的总表面积为1.7平方米（https://www.calculator.net/body-surface-area-calculator.html），该树干由总表面积52的36％组成约36％，大约45％的树干面对莫斯基特群岛的45％。为了进行实验，我们使用了一个IR源为0.22 m2（45.5 cm×49 cm），这是对蚊子可用的IR源面积的保守估计。我们覆盖了由不锈钢（Hatco，GRS-36-i）制成的0.44平方米（91厘米×49厘米）的电板，并用白色接触纸（发射率为0.92），然后将板加热至34°C。为了阻止板的一半，我们将一个透明的丙烯酸面板放在板的一半前10厘米（图2i）。为了防止从34°C的IR表面进行对流热，到达我们用来执行行为测定的蚊子笼子，我们将高IR-IR传播的PE膜放在笼子前。将丙烯酸面板作为IR和非IR侧之间的屏障放置，以防止对非IR侧的IR辐射进行任何出血。二氧化碳通过附着在笼子前面板顶部的穿孔管释放在笼子的面向IR面积表面（图2i）。通过擦拭笼子网的整个前表面5-10倍的整个前表面的磨损手套来使用人类气味。

　　为了进行行为测定，我们将80个雌性蚊子转移到了测定笼中，并允许它们至少适应24小时，同时允许他们以10％的蔗糖和余地为食。然后，我们将笼子放在距IR表面不同的距离上，并通过记录蚊子在存在人类气味和5％（v/v）CO2的情况下将蚊子降落在面向IR和非IR侧的网格上，通过记录蚊子在面向IR和非IR边的网眼上进行运动5分钟。

　　为了修改我们的设置以使蚊子从34°C源中暴露于所有三种形式的传热（导电，对流和辐射）中，我们取下了对流屏障（PE），并位于两个毛刺（一个在34°C下）（一种在29.5°C时），因此可以在所有形式的传输中进行散布，从而允许所有形式的传递。为了进行行为测定，我们将80个雌性蚊子转移到了测定笼中，并允许它们适应≥24小时，在此期间，它们被允许以10％的蔗糖和余地为食。然后，我们将笼子放在竞技场内，并通过记录在笼子的网眼上降落在人类气味和5％（v/v）CO2的情况下，通过记录笼子的网眼，监测他们的宿主寻求行为5分钟。

　　为了使蚊子从50°C的毛源源中暴露于所有三种形式的热量中，我们通过删除对流屏障（PE）并将设置的单个毛细管设备设置在50°C齐平在50°C冲洗式笼子上，从而修改了设置（请参阅“进行IR-Preference Assays”部分的设置）。这使蚊子可以暴露于所有三种形式的传热：对流，传导和辐射。行为测定是在二氧化碳和人类气味的情况下进行的。优先测定是在上面直接用完整的野生型（LVP）雌性的修改设置中进行的，或者用雌性蚊子去除去触角的远端末端。我们以传导/对流/IR设置（降落在板上）为50°C，将蚊子的厌食症厌恶到50°C，并将笼子表面暴露于人类气味和5％CO2。计算了在10×10 cm 50°C peltier板（区域1）上降落在相同大小（100 cm2; 2区2）上的蚊子（区域1）的PI（区域1 -HSI的PI = hsi的PI =区域1 -HSI的PI =区域2/HSI的2/HSI 2/HSI区域1+区域1+区域2）。

　　温度探针（TSP01-USB温度和湿度数据记录仪，Thor Labs）位于行为笼中，距行为舞台的壁4厘米，直接与Peltier板直接相对。在对流屏障的到位或去除后，我们在各种条件下记录了空气温度5分钟。我们测量了毛皮尔前方的气温，设置为一系列温度（28-37°C）以及控制毛发（关闭，平衡到环境条件）。此外，我们用铝箔屏蔽了温度探针，以防止IR加热事件，同时仍允许探头周围充足的空气空间以进行测量。因此，我们计算了平均温度值以及最低和最大记录值（扩展数据图2a，b）。

　　为了测量不同毛发温度的IR水平，以及与毛皮物的不同距离，我们使用了dlatg（脱硫 - 丙氨酸 - 丙氨酸掺杂的硫酸硫酸硫酸硫酸甲酯）类型的pyroelectric IR探测器（Bruker，D301），其溴化钾具有光谱范围范围为1-25μm和Sensor Sensor 2 sensor and sensor and sensor systrage and sensor and Sensor systrage。来自IR源的信号通过20 Hz的光学斩波器调节（Scitec Instruments，340CD），并使用锁定放大器（Stanford Research Systems，SR530）测量信号。

　　为了在不同温度（28°C，31°C，34°C和37°C）下从毛皮尔装置的IR信号中测量IR信号，我们最初在不同温度下从黑色绝缘泡沫中散发出的黑色体辐射的标准图。黑体表面发出的总能量是使用Stefan -Boltzman定律确定的。随后，我们通过考虑逆平方依赖性并假设角度发射来计算传感器的能量。

　　检测器拦截的辐射率的分数被计算为其面积（1 mm2）与半球面积的比率，半径等于IR传感器和IR源之间的距离。这为我们提供了黑色身体样品区域的传感器区域上的黑体辐射。然后，在不同温度（28、31、34和37°C）下，通过MV（从Lockin放大器）与黑体信号的测量信号的比率缩放了Peltier设备获得的值。这种调整使我们能够在不同温度（28-37°C）下得出IR信号的强度。

　　类似地，为了在34°C下从不同距离（8、10、15、20、25和30 cm）计算IR信号强度，在34°C下，探测器截取的辐射截止比例的比例（1 mm2）与半径与Radius距离的面积（1 mm2）的比率等于不同距离，等于radius的距离等于不同的IR传感器和IR源。这为我们提供了黑色身体样品区域的传感器区域上的黑体辐射。然后根据MV中测得的信号与黑体信号的比率缩放在不同距离（8–30 cm）下为peltier设备获得的值。这种调整使我们能够在不同距离下得出IR信号的强度。

　　我们使用的是硅（Si）IR窗口（直径为100毫米，厚度为0.5 mm，边缘上有一个小凹口），其传输范围为1.2-7μm，尽管即使在此范围内，SI Wafer也会降低IR变速箱。Si晶片有效地阻断了高于7μm的大多数IR波长（Soka Technology，P100）。由于阻塞效率取决于窗口的厚度，因此我们使用多个Si晶圆来为IR阻塞创建剂量反应。厚度（1 mm，2 mm和3 mm）的变化用于有效地阻断IR从34°C IR源中。使用IR热成像检查IR阻塞的效率。由于Si晶片的尺寸与Peltier尺寸不同，因此我们切开纸板以匹配Si晶片的尺寸，并将纸板放在34°C的Peltier前面。通过在Flir Ignite软件的颜色分布设置中设置相同的颜色空间来标准化图像的背景。IR阻断实验表明，3 mm厚的IR块窗口从34°C的源中基本阻塞了IR。为了执行行为实验，将相同的IR阻断Si晶片放在两个毛刺的前面，以防止任何视觉偏见。在这种改良的设置中，用野生型（LVP）女性进行了偏好测定，其中一个IR块窗口厚度不同，其中一个毛刺在34°C下，另一个毛皮在环境中为29.5°C。双方暴露于人类气味和5％CO2。

　　我们使用自动跟踪和评分程序的原因有多种。首先，与其他常规的手动评分方法相比，自动化视频分析大大增加了实验的吞吐量。其次，自动评分减少了在手动计数方法中可能出现的得分偏差的机会。第三，自动化得分使我们能够选择性地学习和评分那些积极地在笼子网（补充视频1）的蚊子，而不是那些静止的蚊子。

　　我们最初尝试了市售或开源跟踪程序；但是，它们要么太麻烦了，耗时或无效地跟踪蚊子。因此，我们开发了一组定制的脚本，以使用MATLAB（MATHWORKS）跟踪和评分我们的实验录音。本研究中描述的所有代码均可在Craig Montell Lab Github存储库（https://github.com/craig-montell-lab/chandel_debeaubien_2023）上获得。

　　跟踪程序产生了阈值图像（黑白），其中蚊子像黑色背景一样出现黑色斑点（补充图1b，c）。这些斑点的质心（中心）坐标记录并存储在实验的每个视频框架中（99.8％为5分钟×10 fps = 3,000总帧）。为了有选择地研究寻求寄主的蚊子，我们随着时间的流逝重建了同一蚊子的运动。我们使用了最接近的邻居函数，该功能具有最大切割值，以将连续框架缝合在一起。这种方法使我们能够在整个5分钟实验记录中重建单个蚊子的轨迹（补充图1d，e）。

　　对于与IR检测有效距离相关的视频，我们对上述的视频使用了几乎相同的方法，仅修改了我们的前景检测方法。由于这些视频的背景发生了很小的变化，因为我们将笼子与红外源的距离更改为距离，因此我们选择为每个视频创建一个背景模型，而不是使用固定的像素阈值。为此，我们从每个视频中随机提取100帧，然后计算模态像素值。所得图像被用作背景模型，因为它没有所有移动对象（蚊子）。为了识别蚊子，我们在每个帧和背景模型之间对像素值的绝对差异，阈值像素更改> 30个任意单位。这种坚固的鉴定在前景中的蚊子斑点，然后进行相同的滤波，如上所述。

　　我们分析了蚊子运动，以识别定量特征，使我们能够选择性地研究寻求宿主的蚊子。首先，我们将位置数据与落在笼子网上的蚊子中分离出来，并从正在飞行的蚊子中删除了数据。为此，我们分析了在5分钟的实验记录中捕获的所有斑点区域（像素）。通过分析人体尺寸的分布，我们发现陆地蚊子的分布落在确定的范围内，几乎总是比飞行蚊子的蚊子大（补充图1F）。在视频录制中，飞行的蚊子看起来比登陆的蚊子不透明，导致图像阈值后的大小显着较小。因此，为了有选择地研究已经降落的蚊子，我们将落入定义范围内的身体大小的数据阈值（补充图1F）。

　　有了孤立的蚊子降落在笼子网上，我们想从积极寻求的蚊子中分离出数据。在这里，我们将寻求的主机定义为沿着笼子网走，这与探测行为相关（补充视频1）。由于我们无法直接从录音摄像机的有利位置观察探测，因此我们将步行运动用作这种行为的代理。为了确定静止和寻求主机的行为特征，我们手动生成了两个代表性的静止和寻求蚊子运动的数据集。这些数据是从实际的实验数据中策划的。通过分析这些数据中速度的分布，我们确定了一个阈值值，该阈值在超过运动中代表运动中的蚊子（补充图1G）。请注意，固定蚊子看似矛盾的速度是由于该固定物体的计算出的质心位置略有差异，称为抖动。这些步骤后的其余数据代表了积极寻求宿主的蚊子，并在本研究中描述的所有行为实验中用于分析。总体寻求的总体寻求称为HSI，计算为每个视频期间寄主寻求观察的总数（99.8％为5分钟），除以帧总数（例如，5分钟视频中的3,000帧）。换句话说，HSI代表在任何给定时间寻求主机的平均蚊子数量。此外，对于图3A所示的实验，我们通过在给定时间点以一个区域中的一个区域中寻求寄宿的蚊子的总数除以实验总数（18个实验，6个生物学复制，3个技术复制）来计算IHSI。该度量表示在该时间点，在该区域中寻求蚊子的平均数量。作为。斯蒂芬西很少在笼子的后部走来走去， 我们选择了基于步行速度的IR数据阈值，而是包括所有着陆事件的数据。

　　如上所述，自动确定的HSI不仅测量步行，还包括对长鼻的探测的要求。这与以前使用的手动计数方法不同，这些方法无法区分随机着陆和显示与寻求血液相关的行为的蚊子。因此，我们比较了使用HSI的敏感性，并每30秒从视频中手动量化每个区域中的蚊子数量。我们发现，与我们的自动评分方法相比，手动计数不足的IR区域的偏好（扩展数据图2C）。我们总共录制了1,483个视频（请参阅数据可用性部分），其中1,480个视频持续了5分钟。唯一的例外是IR 1878（3.60分钟）和IR 1882（4.89分钟），与图3E相对应，SI 10（4.82分钟），对应于图3B。

　　在这项研究中，我们使用PI指标来总结给定行为分析过程中蚊子的偏见或无偏分布。该指标考虑了所有寻求蚊子主机的观察结果。因此，如果将数据点馈入该度量标准，则随机变化会显着影响实验结果。我们想确定本研究中包括或排除实验的最低可接受的HSI的知情理由。为了研究响应率如何影响实验结果的总体差异，我们创建了一个通过实际实验参数告知的模型。我们首先分析了实验数据，以识别寄主寻求时蚊子运动的关键特征。通过检查运动的方向性，我们发现寻求蚊子大多在没有左/右偏见的情况下行走（补充图1H）。使用这些信息及其平均速度，我们创建了一个随机行走模拟，该模拟近似于运动持续时间，速度和寻求蚊子的方向性（补充图1i，j）。

　　为了模拟HSI对实验差异的影响，我们在二维环境中填充了一定数量的虚拟蚊子，其维度与实际实验相同（720×1,280总计，有两个466×456得分区）。我们使用先前描述的运动模型模拟了蚊子运动。蚊子的输入数量为1到30，并且在每个输入号上，该模型迭代10,000次。然后，我们以与真实的实验数据相同的方式分析了所得运动，并记录了PI和HSI。由于起始位置是统一的随机位置，我们希望模拟的PI结果的平均值约为0。我们发现，HSIS低的结果的分布非常广泛，在极端情况下，PI的PI范围为-0.99至0.95（扩展数据图2D）。这些表明，在极低的HSIS下，数据代表潜在偏好的能力很差。此外，随着HSI的增加，方差的非线性降低（扩展数据图2D）。有了这些信息，我们确定了将实验包含在随后的分析中所需的最低HSI为5。我们之所以选择这个阈值，是因为在较高的响应水平下几乎没有额外的方差降低，并且从技术上讲，这将需要增加每个测定的蚊子数量以实现此类HSIS。在这项研究中，我们分析了522种生物学重复。每个生物学重复都包括≥3个技术重复。所有技术重复中的8％被排除在外，因为它们不符合HSI阈值（HSI = 5）。这导致了所有生物学重复的85.2％是根据≥3个技术重复的平均值计算得出的（522分之445），而从2个技术重复（522个中的77个）计算出14.8％。

　　为了确定哪些行为或行为与PI的变化密切相关，我们分析了982个个人行为实验。我们首先研究了PI的转移是否与蚊子平均在首选区中花费更长的时间相关。为此，我们通过将在每个区域中所花费的累积宿主寻求时间除以在该区域中观察到的曲目（bouts）来计算每个区域的ATT差异（扩展数据图5A）。将每个实验的数据标准化为在所有区域中花费的平均寻求宿主的时间，提供的度量为-1至1。 <1 indicates that, in that experiment, individual mosquitoes spent on average more time occupying zone 1 while host seeking compared with zone 2. An ATT score of >因此，1将显示逆。

　　我们分析的下一个指标是每个区域之间ATD的差异（扩展数据图5B）。强大的PI的一种解释是，蚊子更容易离开一个区域，而另一个区域则以偏斜的ATD分数显示。这是以与ATT分数相似的方式得出的，其中我们计算了区域1和2之间的归一化ATD差异。 <1 would suggest that mosquitoes on average walked longer bout lengths in zone 1 as compared to in zone 2, and the inverse is true if ATD >1。

　　最后，我们想对每个区域之间的DTT进行评分。这将反映出通往该区域并表现出宿主寻求行为的蚊子的总数（扩展数据图5D）。为此，我们计算了轨道总数的归一化差异，范围为-1至1。 <1 indicates that, in that given experiment, there was a greater number of overall host-seeking bouts in zone 1, and conversely more in zone 2 when DTT >1。

　　为了检测使用逆转录PCR（RT -PCR）和QPCR在天线中TRPA1和OPSIN mRNA的表达，我们使用TRIZOL试剂（Thermo Fisher Scientific）从200个天线中分离了RNA。我们使用上标III逆转录酶（Thermo Fisher Scientific）用Oligo（DT）引物制备了cDNA。对于RT – PCR，我们使用Phusion高保真DNA聚合酶（新英格兰Biolabs）放大了32个循环，对于QPCR，我们使用LightCycler 480 Sybr Green I Master I Master Master Mix（Roche）放大了40个周期。我们使用RPL17作为归一化参考。PCR引物在下面列出。使用对照和突变体制备的RNA用于生产指定基因（TRPA1，OP1和OP2）和RPL17的PCR产物。将TRPA1，OP1和OP2和RPL17的PCR产物装在相邻的井中，上面是相同的1％琼脂糖凝胶的井中。来自两个生物重复的原始扫描如图3所示。

　　PCR引物如下：OP1-F（5568060），5'-AgagaCipipal Goests； OP1-R（5568060），5'-GAACGTGTGTGICCCA-3'; OP2-F（55676800），5'-CTGTCCGAGAGAGAGAGAGAGAGEGIACTS-3'; OP2-R（55676680），5'-GGTCAGTAGTCAGTCAGTCCGC-3'; OP3-F（5568061），5'-GGCACTCCTGGTGTGTTC-3'; OP3-R（5568061），5'-TCGTGAGCAGCAGCTTAAT-3'; OP4-F（55666757），5'-atCtgickGtgTggGICS-3'; OP4-R（5566757），5'-GAAGTCCSIGIONS-3'; OP5-F（5566755），5'-AACATGAGCTGTGGAAC-3'; OP5-R（5566755），5'-GTAACCSGTTCATATATATATICAGTG-3'; OP7-F（5569125），5'-CGTGGTCGTGGHT-3'; OP7-R（5569125），5'-gatgtgicaghtghtght-3'; OP8-F（5572198），5'-actatctggcatggtggtgctggggg-3'; OP8-R（5572198），5'-attgcatgctggggggggg-3'; OP9-F（5576882），5'-TTGCGTGTTCTGTGGGGGG-3'; OP9-R（55768882），5'-CTTGCGTASITS-3'; OP10-F（5566350），5'-CGCTCCGGGASGTGGGTGGGTGGGGGGGGGGGGGGGHTGGHTS； OP10-R（5566350），5'-TCTTAGCAAGITGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGT; OP12-F（55664410），5'-GGCCAATCAGTGTGTGTGTGTCCCG-3'; OP12-R（55664410），5'-TCGGCTATCSITGTGTCCCG-3'; TRPA1-F（5571938），5'-TGTTATCAAAAAGTCTCTCAGHT-3'; TRPA1-R（5571938），5'Acagters-3'; RPL17-F（55748666），5'-AAGOGTGGCTCTCCA-3'; RPL17-R（55748666），5'-GGTCTCCGGTCGTC-3'; OP1-RT-F（5568060），5'-Caactagttcgtcgtcgtcgtt-3'; OP1-RT-R（5568060），5'-GGCCTCATCITS-3'; OP2-RT-F（55666680），5'-CCAACCTTGTGTGTGTCAAT-3'; OP2-RT-R（55666680），5'-GTAGAGATGE-3'; TRPA1-RT-F（5571938），5'-actgtaaAccgTCCGTAG-3'; TRPA1-RT-R（5571938），5'-tatctTgggggggTgTgTgTgTGTGTAAT-3'。

　　我们设计了一个修改后的RNASCOPE53协议，用于全座艾德斯染色。简而言之，ae。通过高级细胞诊断（ACD）对靶基因AAE-LOC5571938（2326–3239 bp of XM_021842755.1，TRPA1），AAE-AAEAL005776（875-1770 bp of NM_0013584771358471.11358471.11.135584771），通过高级细胞诊断（ACD）（ACD）设计了Aegypti探针（ACD）（ACD）（ACD）（ACD）（ACD）（ACD）（XM_001657569.3，OP2的900–1397 bp），AAE-LOC5568060（2–1378 bp of XM_001651947.3，OP1），AAE-AAEL018153（1202-2119 bp of XM_02119 BP of xm_02184444444.1，1202-2119 bp ofRNASCOPE实验是在Eppendorf管中的全置触角上进行的。将大约10个触角解剖为PBS，用PBS洗涤一次，并在4％的PBS中固定在4°C的PBS中16小时。然后将每个样品在PBS中的一系列50％乙醇中脱水，PBS中的75％乙醇和100％乙醇。最后一次洗涤后，将乙醇完全去除，并在室温下将组织干燥30分钟。然后将组织用3％H2O2在PBS中处理10分钟，以使内源性过氧化物酶活性失活。然后将样品在rnascope蛋白酶III中孵育30分钟。探针杂交在40°C下过夜。第二天，将组织在rnascope洗涤缓冲液（ACD，310091）中洗涤3次，持续2分钟。然后根据制造商的说明，将组织与RNASCOPE多重荧光V2测定试剂盒（ACD，323100）中的放大器溶液（AMP1-3）孵育。将组织在40°C下在AMP1中在AMP1中孵育2小时，在40°C下在40°C下孵育2小时，在40°C下在40°C下孵育1小时，在40°C下持续2 h。在每个步骤之间，在室温下将组织洗涤五次，每次3分钟。对于荧光标记，使用1：500的蛋白石染料（Akoya Biosciences）与TSA缓冲液的1：500比例使工作蛋白石染料溶液新鲜。然后，我们将150 µL的工作溶液添加到包含约10个天线的每个管子上，并在40°C下孵育2小时。然后将组织在洗涤缓冲液中洗涤，并安装在Vectashield安装介质中（矢量实验室）。在对照和突变触角样品中重复三次实验。使用Zeiss LSM 900共聚焦显微镜和Leica SP8共振共聚焦显微镜获取图像。使用ImageJ生成了全Z堆栈的最大强度投影。使用Imaris（v.10.0.1）进行了第13鞭毛粒的获得的Z堆栈中的三维神经元计数。在Imaris中手动分析每个计数，以删除不是神经元的对象，并添加缺失或重叠的神经元。

　　通过将它们放入0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2），2％戊二醛溶液中固定隔离的天线，然后在4°C下过夜，然后在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2），1％osmium tetroxide溶液中固定次级溶液> 2 h。然后将固定的触角样品用乙醇和丙酮的系列稀释液脱水，并用环氧树脂浸润（电子显微镜科学，14310），嵌入PE成型托盘中并固化在烤箱中。使用玻璃刀在Reichert-Jung Ultracut Microtome上以大约1 µm的厚度将固化的制剂切成大约1 µm，并用甲苯胺蓝色染色，并在光学显微镜下观察到。

　　我们使用了5-10天大的女性蚊子进行EAG录音。将蚊子固定在载玻片上，通过将胸部和腹部连接到双面粘合胶带条上。蚊子的头放在预先连接到幻灯片的盖玻璃顶上。使用双面透明胶带的细条来固定长鼻的胶带以最大程度地减少运动。将用于记录的天线固定在盖玻片上，沿着天线的中部放置了一条细的双面透明胶带。将玻璃电极（世界精密仪器，1B150F-3）拉到Sutter仪器p97拉杆上，并装满了珠子 - 埃弗鲁斯铃声溶液。将电极插入电极奶油液（Parker Laboratories Cream Electrode Signacreme EA，72 BT/CA; 17-05）放在化合物（参考电极）上，并在天线的第13个鞭毛（记录电极）的第13个鞭毛的近端附近。

　　为了输送IR刺激，将维持在37°C的热水浴中的水通过铝板（4 cm×4 cm×1 cm）循环，以使表面的最终温度为34°C。通过使用操纵器将加热的板从天线放置3厘米，并施加刺激，并将板面向天线的板的4 cm平方表面较宽。该表面用白色接触纸覆盖（发射率为0.92）。为了确定IR（34°C块）的来源不会因导电热而改变制剂部位的温度，我们测量了环境温度。

　　为了测试蚊子是否对刺激有反应，我们在暴露于34°C刺激之前将它们暴露于阳性对照（口腔），并确定痕量中是否有反应。如果蚊子没有引起对阳性对照的EAG反应，则将其排除在分析之外。如果对IR没有反应，我们在刺激后进行了阳性对照。如果对口腔泡芙的反应为负，我们排除了数据。为了测量刺激应用后的现场电位变化，使用IDAC-4放大器扩增EAG信号并使用EAGPRO软件（Ockenfels Syntech）进行数字化。使用以下公式来测量每种刺激后的振幅变化：（刺激后5 s之内的峰值响应的值） - （刺激前的平均场电位为5 s）。

　　使用初步实验的数据用于确定典型的S.D.在行为实验结果中（σx= 0.12）。我们预定了PI的效应大小为±0.2的效果大小是感兴趣的，因此，每种处理的6个重复的n n将足够动力。所有行为实验组（例如基因型，状况）均由6（n = 6）个生物学队列（生物学重复）组成，平均重复测量（技术重复）。对于使用两组设计的实验，使用参数两尾学生的t检验确定了组平均值的显着差异。对于> 2个治疗组的实验，使用单向方差分析分析了组平均值的差异，然后进行了Tukey的多比较测试。星号表示意义。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。