没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，除了指示，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。

　　在补充有10％胎牛血清的Dulbecco修饰的Eagle的培养基（DMEM）中培养Vero E6细胞（M e，Müller的礼物），1倍非必需氨基酸，100单位ML-1 Penicillin和100μgMl-1链霉素。将表达SARS-COV核蛋白（N）23,24的婴儿仓鼠肾（BHK）细胞保持在最小必需培养基（MEM）中，并补充了5％胎牛血清（FBS），1倍非必需氨基酸，100单位ML-1 Penicillin和100μgMl-1 G41 G41 G41 g41 G41 G41 g41 g41 g41 g41 g4 ml-liml-g41 g4ml-liml-g4ml-g4ml morcin morcin morcin，500 ml-g4ml-g4ml-g4ml-limincimcin，500 ml-g4ml-liminsML -1嘌呤霉素。电穿孔前二十四小时，用1μgml-1多西环细胞处理表达SARS-COV N的BHK细胞以表达SARS-COV N蛋白。将所有细胞系保持在37°C和5％的二氧化碳气氛下。

　　实验293表达系统（热泡科学）用于产生HACE2，并构建了哺乳动物链球菌表达质粒来编码密码子（hACE2-FC）（HACE2-FC）（HACE2-FC）或多组氨酸标记的S（s and S（d614g）），SC（D614G）– secod ins Scodod和secod secod和多组的secod odod secod和多组的sc.突变的脂蛋白裂解部位和K986P/V987P取代）。用质粒转染EXPI293F细胞，并在37°C下以8％CO2培养，以125 rpm的震动速度。通过在4°C下以3,000克离心20分钟，在第5天收集上清液。使用含有0.1 M柠檬酸的洗脱缓冲液中的HITRAP蛋白A柱（GE Life Sciences）纯化HACE2 -FC蛋白，pH 3.0。使用Histrap FF柱（GE Life Sciences）在装有20 mM磷酸钠，0.5 m NaCl和500 mM咪唑，pH 7.4的洗脱缓冲液中纯化S。使用Zeba旋转脱盐7K MWCO（Thermo Fisher Scientific）对洗脱液进行脱盐。将纯化的蛋白进一步集中在50K NMWL（Sigma-Aldrich）的Amicon Ultra离心过滤器上，并使用Qubit蛋白测定法（Thermofisher Scientific）进行定量。

　　HACE2 -FC和S1（ABCLONAL，RP01262），S1（D614G）（Abclonal，RP01287），S或S（D614G）之间的亲和力在30°C中使用Octet Red96仪器（FORTEBIO）评估，并以1,000 rpm的震动为单位。在抗人FC捕获生物传感器和传感器检查1分钟的预选制20分钟后，将10×动力学缓冲液（Fortebio）中的7.5 nm HACE2 – FC加载到生物传感器表面上5分钟。基线平衡1.5分钟后，使用25至200 nm的S1或S1（D614G）或S1或S（D614G）进行了5分钟的关联，然后在用于基线平衡的相同缓冲液中分离5分钟。通过减去参考样本来纠正数据；具有全局拟合的1：1结合模型用于测定亲和力常数。

　　将BHK – HACE2细胞的稳定克隆重固定，并在反应缓冲液（PBS PH7.4，pH7.4，二20％和4％BSA）中，浓度为5×106细胞，每毫升。将每个细胞的一百微晶体等分为圆底96孔板，并在冰上孵育至少5分钟。多组氨酸标记的S1（40591-V08H）和S1（D614G）（40591-V08H3）和FC标签的S1（40591-V02H）和S1（D614G）（D614G）（40591-V02H3）蛋白从Sino Biological and Dilotic Fuffers中购买了冰，并在冰上购买了冰上的冰上。将五十微升的S1稀释剂添加到相应的细胞孔中，并在冰上孵化20分钟。孵育后，将细胞在200μLPBST洗涤溶液中洗涤一次（PBS PH7.4，pH7.4，二十二含0.02％），然后100μl的1：300稀释的二级抗体（Thermofishercat。No。A-21091）用于FC TAG和THERMOFISHER CAT。摇动15分钟。洗涤两次后，将细胞重悬于200μlPBST中，并使用BD FACSCANTO II流式细胞仪进行分析。使用FlowJo V.10.6.1处理数据。BHK对照细胞的结果（未表达HACE2），并且在补充图2中提供了门控策略。1，2。

　　为了将D614G取代的突变引入S基因中，使用Q5位置定向的诱变试剂盒（New England Biolab），在含有SARS-COV-2片段1010的PUC57质粒上进行了PCR诱变（补充表1）。如先前所述1010，使用与内外转化相关的重组克隆方法生成S和SD614G感染性cDNA克隆。如前所述4，使用T7 Ribomax大型RNA生产系统（Promega）进行了EAGI旋转的YAC和PCR放大的SARS-COV-2 N基因进行体外转录4。将转录的mRNA电饰带入表达SARS-COV N蛋白的婴儿仓鼠肾细胞（BHK-21细胞）中。将电穿孔的细胞与易感的Vero E6细胞共培养，以产生重组SARS-COV-2D614和SARS-COV-2G614的通过0。随后，使用后代病毒感染新鲜的E6细胞，以生成通道1库存以进行下游实验。

　　如先前所述，进行了Vero E6中病毒生长动力学的表征。感染前二十四小时，将细胞以每毫升2.0×105细胞的密度为24孔板中。用PBS洗涤一次后，以0.01的多种感染性接种病毒。1小时后，除去接种物，并用PBS洗涤3次细胞，然后用适当的培养基供应。

　　每毫升重组SARS-COV-2D614和SARS-COV-2G614的PFU通过斑块测定24孔格式测定。感染前一天，将Vero E6细胞以每毫升2.0×105细胞的密度接种。用PBS洗涤一次后，将细胞用1:10稀释的细胞培养基中连续稀释的病毒接种。孵育1小时后，除去接种物，并用PBS洗涤细胞，然后用2.4％avicel和2×DMEM覆盖，并补充了20％的胎牛血清，200单位ML -1 Penicillin和200μgML -1链霉素。在37°C下孵育2天后，将细胞固定在4％（v/v）中性缓冲福尔马林之前，然后用晶体紫染色。

　　统计显着性由双面未配对的学生的t检验确定，而无需调整多次比较。

　　根据制造商的说明，购买并处理了原发性人类鼻上皮细胞培养物（Mucilair EP02，上皮Sàrl）。购买人类NBE细胞（从埃默里大学）购买，并根据建议的方案进行培养。人鼻上皮培养物被每孔的0.5×105 PFU接种，或SARS-COV-2D614和SARS-COV-2G614的1：1、10：1和1：10的混合物。人NBE细胞培养物被1.0×105 PFU接种，或野生型分离株SARS-COV-2/USA-COV-2/USA-WA1/2020（SARS-COV-2D614）或SARS-COV-2/MASSACHUSETTS/VPT1/2020（SARS-COV-2G614）（SARS-COV-2G614），以2×105 TCID50 pcid50 pcid 50（SARS-COV-2G6114）。对于竞争实验，每孔以1×105 pfu，将人类NBE细胞用1：1或9：1混合的SARS-COV-2D614和SARS-COV-2G614接种。在33°C孵育1或2 h后，对于人鼻上皮或人NBE细胞培养物，将接种物除去（或以2-h样品为2-H样品收集），洗涤细胞，然后在33°C，37°C或39°C下（如指示）孵育（如指示）。为了监测病毒复制，每24小时收集一次顶部洗涤。所有滴定均由Vero E6细胞上的标准斑块测定法或TCID50确定。

　　对于竞争实验，使用QIAAMP 96病毒Qiacube HT试剂盒（Qiagen）从顶端洗涤中提取病毒RNA。SARS-COV-2基因组通过基于ARTIC网络协议（https://www.protocols.io/view/ncov-2019--sequecov-prototocolococol-bmuik6w）的高度多路复用的瓷砖PCR反应进行扩增。简而言之，底漆被设计为产生重叠的1-kb扩增子（补充表1）。逆转录酶如前所述的网络协议中所述进行。通过制备两个PCR反应（一个用于奇数甚至之前的底漆池），将单个cDNA反应前进。准备两个引物池（奇数和偶数），以含有0.1μm的每个单独的底漆。通过将12.5μl2×Q5聚合酶，5.5μl水，2μL引物池和5μlcDNA结合使用，进行所得cDNA的瓷砖PCR进行，然后在98°C下在98°C孵育30 s，38个循环，38个循环，38个98°C的5 s和63°C，在5 min，4 min，4 min，4 min，4°C中孵育。对相应的奇数甚至扩增子进行标准化并汇总以进行库制备。使用Nextera XT DNA文库制备套件制备了碎片的文库，并使用Illumina Miseq进行了测序。使用SARS-COV-2模块使用IRMA25进行分析。

　　如先前所述1010进行了病毒RNA的NGS准备。简而言之，Vero E6细胞被通道-1病毒感染。根据制造商的说明，使用Nucleospin RNA Plus Kit（Macherey-Nagel）提取总细胞RNA。

　　根据制造商的方案，使用Qiaamp病毒RNA Mini Kit（Qiagen）和Nucleospin RNA试剂盒（Macherey-Nagel）制备了人鼻上皮细胞和小鼠口咽拭子的顶端洗涤的RNA。

　　为了确定SARS-COV-2D614与SARS-COV-2G614在人鼻上皮细胞培养物和HACE2敲门小鼠中的竞争测定中的比率，使用Superscript IV IV IV一步一步的RT – PCR系统（Invitrogen）在提取的RNA上进行了反转录PCR。序列特异性引物用于生成覆盖D614区域的905 bp的扩增子：5'-aatctatCaggcgcggCggTagCAC-3'和5'-caacagctattccagttaaagcac-3'。使用0.01 pg至1μg总RNA，在50μl反应中进行了RT – PCR反应。循环参数如下设置：50°C 10分钟，98°C持续2分钟；在98°C的35个循环10 s，55°C 15 s，72°C 30 s；并在72°C下孵育5分钟。使用Qubit DsDNA HS（高灵敏度）测定（Thermo Fisher）测定DNA浓度，然后在50μl无核酸酶水中稀释至200 ng，以通过纳米孔测序小子进行测序。

　　在低和无拷贝的实验室环境中进行了RNA提取和RT-PCR反应的制备，以避免污染。

　　如先前所述1010，NGS对重组SARS-COV-2D614或SARS-COV-2G614 RNA的RNA进行了测序。简而言之，根据制造商的指南，使用Nucleospin RNA Plus Kit（Macherey-Nagel）从被重组SARS-COV-2D614或SARS-COV-2G614感染的Vero E6细胞中提取RNA。随后，使用Illumina Truseq搁浅的mRNA图书馆预备试剂盒（Illumina，20020595）制备了测序文库，并使用Novaseq 6000 S1流动池（2×50 BP，100个循环）使用Illumina NovaseQ 6000 Novaseq 6000平台（下一代序列平台（下一代序列平台）在两个novaseq 6000 S1流动池（2×50 BP，100个循环）上对两个车道进行测序。为了进行数据分析，使用Trimgalore v.0.6.5来删除原始测序文件中的低质量读取和适配器。然后，将所得的修剪成对末端读数对齐与SARS-COV-2基因组（GenBank登录MT108784）使用Bowtie2 v.2.3.5。最后，使用Samtools v.1.10为每种病毒量生成共识序列，将-D选项设置为10,000。数据分析是在伯尔尼大学（http://www.id.unibe.ch/hpc）的Ubelix上进行的。

　　对于人类鼻上皮细胞的病毒竞争实验，HACE2敲击小鼠，仓鼠和雪貂，在牛津纳米孔的奴才系统上对扩增子进行了测序。实时高准确的基础呼叫，消除式和条形码和适配器修剪是通过Minknow v.20.06.17进行的，运行Guppy V.S4.0.11。下游分析是在Geneious 2019 V.S2.3中进行的。读取长度被过滤以消除读取 <800 and >1,100 NT和其余的读数在10,000个读取的子集中映射到接受2次迭代的扩增子参考，自定义敏感性允许最大5％的间隙和最大不匹配30％。在计算每个变体的P值的特定位置上分析了变体。比例分数A/G是根据读数的数量计算的，因为分数= a读取/（a读+g读取）。

　　使用R中的CATSEYES软件包，对SARS-COV-2G614的CATSEYES软件包进行了对病毒竞争实验的统计分析和相对复制的适应性计算，通过SARS-COV-2D614的相对复制适应性值，通过将最初的SARS-COV-2G614/SARS-COV-2G614/SARS-COV-2D6114比（I0）除以最终（ISTAR）的最终（ISARS-COV-2D614）。根据公式W =（F0/I0），SARS-COV-2G614/SARS-COV-2D614比率（F0）。具体而言，要在每个实验中模型F0/I0模型，根据单个样品（感染后，时间点T1）和接种物（初始时间点T0）在单个样品中获得的每个病毒的测序计数计算T1/T0比。对于每个时间点，在R中生成一个线性回归模型，并通过模型组项的系数评估两组之间的适应性比（变体）。进行多个实验时，模型中包括实验变量。所有统计检验均在R（V.4.0.2）中进行，两侧α= 0.05。如前所述20，使用R26中的CATSEYES软件包创建了CAT的眼图SARS-COV-2G614在每个实验中的SARS-COV-2G614上的相对复制适应性。

　　HACE2敲入小鼠最初是在纽约州卫生部Wadsworth中心生成的（IACUC协议号09-405）（首席研究员D.E.W.）。遵守瑞士动物福利立法进行了小鼠实验，并由伯尔尼州的动物委员会审查并批准了动物研究，并批准了BE-43/20。所有的雪貂和仓鼠实验均由梅克伦堡 - 西部波默拉尼亚州农业，食品安全和渔业办公室负责的伦理委员会（LALLF M-V）评估，并在注册号下获得了政府批准，并在注册号LVL MV TSD/7221.3-1-1-041/20。该项目还从CDC的动物护理和使用计划办公室获得了许可。

　　对于HACE2敲击小鼠的产生，HACE2敲击（B6）（B6.CG-ACE2TM1（ACE2）DWNT/J）线是通过靶向诱变产生的，以代替小鼠ACE2基因表达人ACE2 cDNA。因此，在该小鼠模型中，HACE2表达受内源性小鼠ACE2启动子和增强子元件的调节。靶向载体（WEN1-HR）将人ACE2 cDNA与小鼠ACE2的内源性启动密码子插入框架中（扩展数据图3A）。人cDNA的侧面是Frt-neomycin-frt-loxp盒和远端LOXP位点。WEN1-HR用于转染129SV/PAS胚胎干细胞，并分离了837个胚胎干细胞克隆，并通过PCR和Southern blot筛选出同源重组。鉴定了11个正确重新组合的胚胎干细胞克隆，其中一些被用于胚泡注射和植入雌性小鼠，以产生22个具有嵌合体的雄性创始人（129SV/PAS：C57BL/6），范围为50％至100％。为了完成HACE2敲击，我们用C57BL/6J FLP的雌性小鼠越过了嵌合雄性小鼠，以切除FRT fant的新霉素选择盒，并生成floxed的人源化ACE2等位基因（扩展的数据图3A）。通过PCR鉴定出这些HACE2敲击小鼠，并通过Southern印迹确认，并在本研究之前将七代小鼠回到C57BL/6J小鼠中。这条线已捐赠给杰克逊实验室，以供科学界使用（股票035000）。

　　杂合HACE2敲入雌性小鼠是从杰克逊实验室获得的，C57BL/6J野生型雌性小鼠来自Janvier Lab。所有小鼠在单独通风的笼子（蓝线，tecniplast）中均可适应至少2周（Mittelhäusern）。感染前一周，将小鼠分别放置在单独的HEPA过滤隔离器中（Isocage N，Tecniplast）。用异氟烷（10至12周大）用20μL（即每鼻孔10μl）在内部感染小鼠，并用SARS-COV-2变体（野生型和HACE2敲击小鼠）或模拟培养基（仅野生型小鼠）（仅野生型小鼠），并具有1：1的比例。鼻内感染后，每天监测小鼠的体重减轻和临床体征。每天使用超细无菌羊棉签（Hydraflock，Puritan，25-3318-H）在短暂的异氟烷麻醉下收集喉咙拭子。将拭子的尖端置于0.5 mL的RA1裂解缓冲液（Macherey-Nagel，参考740961）中，并补充了1％β-羟基乙醇和涡旋。在感染和器官被无菌解剖后的第2和第4天，将来自两个独立实验的小鼠组为安乐死，避免了交叉污染。进行了系统的组织采样：（1）肺右上叶，右鼻腔粘膜，右嗅球，右脑半球的一部分，右肾的顶部部分和远端小肠（ileum）的部分，用于RA1裂解液中的RNA隔离；（2）肺中部，下叶和后腔裂片，左鼻结肠，左嗅球，右脑半球的一部分和右肾脏的一部分被收集在MEM中；（3）肺左叶，肝左叶，左肾脏， 左脑半球和局但是的一部分和回肠固定在缓冲的福尔马林中。数据是从两个相同设计的独立实验中生成的。

　　使用子弹搅拌器组织匀浆（Next-Next-Advance）将补充有1％β-羟乙醇的RA1裂解缓冲液中收集的小鼠组织样品被匀浆。将匀浆在18,000克离心3分钟，并在-70°C下储存直至加工。根据制造商的指示，使用兽医RNA和细菌RNA和DNA从均质物中提取总RNA，并根据制造商的指示，从兽医样品（Macherey Nagel，Ref。744200）中提取。用Nanodrop 2000（Thermofisher Scientific）分析RNA纯度。使用Agpath-ID一步RT – PCR（Applied Biosystems），使用5μL提取的RNA模板（Applied Biosystems）进行了5μLTrestedRNA模板。样品以重复处理。在以下条件下，在应用生物系统7500实时PCR系统中进行扩增和检测：在45°C下初始逆转录10分钟，然后在95°C下在95°C的PCR激活10分钟，45个循环的扩增周期（在95°C下为15 s，在56°C和30 s处于56°C和30 s处于72°C下的30 s）。

　　在Compath Core设施（伯尔尼大学）处理固定的小鼠组织样品，切片并用血久毒素和曙红染色。HACE2敲入小鼠和野生型小鼠（感染和模拟）的组织病理肺载玻片由董事会认证的兽医病理学家（S.D.B.）检查并评分，后者对样品的身份视而不见。补充表4中详细介绍了评分标准。

　　六个叙利亚仓鼠（肾上腺皮质仓鼠）（JANVIER LABS）在短期吸入麻醉下被纳马斯的内部感染，使用104.77 tCID50 tCID50，用104.77 TCID50升级为原始材料，以70μLSARS-COV-2D614和SARS-COV-2D614和SARS-COV-2G614相等地感染。在单独通风笼中24小时的孤立住房24小时后，共同设置了六对（每对直接接种的供体仓鼠和一个假接种的接触仓鼠）。每个仓鼠对的外壳在单个笼子系统中严格分离，以防止不同对之间的溢出。在接下来的七天（感染后第2天至第8天）和感染后的第12天，除了每天进行体格检查和身体称重外，还监测病毒脱落。

　　为了评估病毒脱落，在短期异氟烷麻醉下从每个仓鼠中单独收集鼻腔洗涤。从每对的接触仓鼠开始，将每个鼻孔用100μlPBS（1.0倍磷酸盐缓冲盐水）冲洗，并立即收集反流。每个鼻孔和仓鼠都有一个新的移液器尖端，以防止从一个仓鼠到另一个仓鼠的间接溢出。此外，在各个对之间，每对仓鼠都使用了一个新的麻醉系统。在感染后的第8天，发现一个接触仓鼠死亡。尽管他们减少了几乎20％的体重，但其他所有仓鼠都从疾病中恢复过来。在安乐死下，从每个仓鼠中收集血清样品。

　　对于单病毒感染实验设置，通过鼻内途径进行七个仓鼠，每仓鼠105.1 TCID50的SARS-COV-2D614，或SARS-COV-2G614仓鼠104.5 TCID 50（根据原始材料的背部滴定计算）。从第1天到第4天，从这些仓鼠中获得鼻腔洗涤，并记录了体重的变化。呼吸器官的组织面板（包括鼻膜，气管组织，颅内侧和尾部和尾部肺部的颅内侧和尾部部分以及肺淋巴结）在这些仓鼠安乐死后收集。

　　根据仓鼠研究，内部育种的十二个雪貂（Mustela putorius furo）分为两个人的六组。雪貂对的年龄相等（4到18个月之间）。总共有四个雪貂是雌性（两对），八个雪貂是雄性或绝育的雄性（四对）。在各个笼子系统中严格分离每个雪貂的外壳，以防止不同对之间的溢出。每个单独的笼子，通过将125μl上述接种物的125μl灌输（每雪貂105.4 TCID50）灌输在内部接种，从同样混合的原始材料的背部滴定中计算到每种鼻孔中，在短期异氟烷基于基于异氟烷的insestril下计算出来。时间点和采样技术对应于仓鼠使用的方法，尽管使用2×700μlPBS每雪貂进行了雪貂鼻洗涤。接触雪貂未接种。

　　将器官样品在由汉克的均衡盐和ear的平衡盐中含量的1 ml混合物中匀浆，其中含有2 mM-谷氨酰胺，850 mg l -1 nahco3，120 mg l -1 l -1 pyruvate，使用10％的胎儿血清和1％的pen牛糖素 - 3 00％pensumscin- peniclyers -Stroppercin -atsy -StroptercIn AttroptercIn Ath 3 3 00 MinoteptscIn 33 00（Qiagen）并离心以澄清上清液。使用Nucleomag Vet盒（Macherey Nagel），从100μL鼻腔洗涤或器官样品上清液（Macherey Nagel）中提取核酸。使用NCOV_IP4 RT – PCR27（包括标准RNA）确定这些样品中的病毒载荷，这些RNA被数字液滴PCR绝对量化，每个反应的灵敏度为10份。随后将提取的RNA进行小麦测序和数字液滴PCR进行。对于小族测序，使用Superscript IV One-Step RT RT – PCR（Thermo Fisher Scientific），用引物（WU-21-F：AATCTATATCAGGCCGGGTAGCAC; WU-86-R：CAACAGCTATTCCAGTTAAAGCCAC）产生扩增子。分别使用天然条形码1-12（EXP-NBD104）和13-24（EXP-NBD114）在牛津纳米孔的奴才系统上测序扩增子，并与连接套件SQK-LSK109（Oxford Nanopore）一起进行。将库加载在R9.4.1流动池（Flo-min106d）上的小兵上，耦合到销售。如“测序和计算分析”中所述进行的奴才数据分析。

　　为了基于数字液滴PCR的罕见突变和序列分析，使用了Bio-Rad的QX200液滴数字PCR系统。根据供应商的说明，应用了一步的RT-DDPCR高级套件（Bio-Rad）。For the amplification of an 86-bp fragment of both variants of S, the forward primer SARS2-S-1804-F (5′-ACA AAT ACT TCT AAC CAG GTT GC-3′) and the reverse primer SARS2-S-1889-R (5′-GTA AGT TGA TCT GCA TGA ATA GC-3′) were used.为了检测一个样品中的D和G变体，应用了两个等位基因特异性核酸探针：SARS2-S-S-V1D-1834FAM（5'-FAM-TAT CAG GAT GAT GAT GAT GTT GTT AAC-BHQ1-3'）和SARS2-SARS2-SARS2-S-S-S-S-S-S-S-S-S-V3G-1834HEx（核酸位置为小写）。引物和探针的浓度分别为20μm和5μm。为了进行数据分析，使用了Quantasoft Analysis Pro软件（V.1.0.596）。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。