根据美国国立卫生研究院的指南，根据Max Planck佛罗里达神经科学护理和使用委员会的法规对所有实验程序进行了批准和执行。使用C57/B6小鼠。将小鼠保持在18-21°C的12小时光线周期中，湿度为40–50％。我们还使用CAMK2AT286A小鼠在BTSP实验中测试CAMKII的需求。

　　我们将两个单体DiDVENUS（Venus（A206K，Y145W））和小鼠EGFP（EGFP（A206K））融合到RatCamkiiα亚基（2DV-CAMUIα）（Addgene，220366）8,31。T286A（Addgene，220367）和T305D/T306D（Addgene，220368）2DV-CAMUIα突变体是通过限制消化和连接构建的。为了进行ER钙成像实验，我们使用了ER-GCAMP6-210质粒（Addgene，86919）。

　　如前所述32，从野生型或转基因P4 – P8 C57/B6小鼠幼崽制备了器官型海马切片。简而言之，该动物用异氟烷进行了麻醉，然后迅速将其斩首并去除大脑。用McIlwain组织斩波器（TED PELLA）剖析海马并将其切成350 µm厚的冠状海马切片，并将其镀在由培养基中的培养基（Millipore，Millipore，Millipore）中的亲水性PTFE膜（Millipore，Millipore）上，该培养基含有培养基，含有MEM培养基（生命技术），20％Horse horse horse horse horse horse horse horse horse horse horse horse horse horse horse horse horse horse horse horse horse 412.9毫米 - 葡萄糖，5.2 mM Nahco3，30 mM Hepes，0.075％的抗坏血酸和1 µg ML – 1胰岛素。将切片在37°C的5％CO2中孵育。培养7-12天后，使用与2DV-CAMUIα（50μg）33涂层的1.0 µm金珠（8-12 mg）的生物遗传基因转移转染了CA1锥体神经元。对于CAMKII实验，由于CAMKII传感器的尺寸，使用生物学基因枪的质粒转染是最有效的。转染是在体外第7-10天进行的，并在转染后2-7天进行实验。神经元的年龄对应于青少年动物的急性切片34。

　　雄性C57/B6小鼠（P25 – P35或P45 – P60）被异氟烷吸入镇静，并用冰冷的胆碱氯化物溶液灌注。将大脑切除并置于由124 mm胆碱氯化物，2.5 mm KCl，26 mM Nahco3、4 mM MGCL2、1.2 mM NAH2PO4、10 mM葡萄糖和10 mm葡萄糖和0.5 mM Cacl2，pH 7.4与95％O2和5％CO2平衡的pH 7.4。Coronal hippocampal slices (300 μm) from both hemispheres were cut using a vibratome (V1200, Leica) and maintained in a submerged chamber in artificial cerebrospinal fluid (ACSF; 127 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 4 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4 and 25 mM glu​​cose) at32°C持续1小时，然后在含氧ACSF中在室温下。

　　如前所述35,36，在BTSP和急性海马切片中进行了BTSP和急性海马切片中的两光谷氨酸分离。实验是在含有4 mM 4-甲氧基-7-硝基丁丁酰固定基 - 谷氨酸（MNI止氨酸酯）的连续氧化的ACSF的较小的循环体积（约8 mL）中进行的。蓝宝石激光器以720 nm的波长调节，以在距脊柱约0.5μm的小区域中的MNI叶片涂成粉末。对于结构可塑性实验，给出了30个0.5 Hz火车的脉冲脉冲。激光的功率设置为在物镜下测量的2.7兆瓦。这些结构可塑性实验是在MG2+-FR的ACSF（127 mM NaCl，2.5 mm KCl，4 mM Cacl2，25 mm Nahco3，1.25 mm NaH2PO4和25 mm葡萄糖）中进行的，其中含有1μmTTX和4 mm Mni-mm Mm Mm Mm MM-MM-MM-MM-MM-CAIND-CAING-CAING-CAIR-CORED-CORED-95％和95％的OU2。BTSP实验在2 mM Ca2+和1 mm Mg2+中进行。在室温（24–26°C）下进行实验。

　　将全细胞斑块钳电生理实验与谷氨酸未药物结合使用，以在单个树突状棘上诱导BTSP36。首先将细胞在明亮的场或标记的细胞表落荧光显微镜中进行可视化。贴片移液器（尖端电阻为2-5MΩ）包括基于K+的内部溶液，其中含有145 mm K-葡萄糖酸盐，14 mM磷酸氨基氨酸，4 mM NaCl，0.3 mm NAGTP，4 mm mgATP，4 mm mgATP，3 mm asscorbic酸，3毫米 - 阿斯科酸，50-100-100 µm Alexa-594和10 mmMMMMMMMMMH HEPES（4.4 HEPES）（44），24.4 ph。在BTSP实验中，EPSP是通过贴片钳放大器（MC-700B，Molecular Devices）和Digitizer（National Instruments）在电流夹模式下测量的。2–5分钟的染料负荷后，使用Alexa-594的荧光在2Pflim中找到树突状棘。通过MNI-谷氨酸渗透到距脊柱尖端约0.5 µm的MNI-glutamate Unging上，在树突上诱导了未衰老的诱发EPSP。未衰老的诱发的EPSP振幅为0.4-2 mV。一些BTSP实验是在电压钳构型中进行的，将细胞保持在-70 mV。基线谷氨酸诱发的EPSC振幅在5到20 pa之间。这些电压钳实验是使用CS+的内部溶液进行的，其中含有130 mM CS-CS-甲磺酸盐，6 mM KCl，10 mM HEPES，4 mM NaCl，0.3 mM NAGTP，0.3 mM NAGTP，4 mM MGATP和14 mm Tris-Tris-Tris-phosphoppocreatine（Btsppsprots）（Btamp povertage-comptssion）。在室温（24–26°C）下进行实验。在CAMKII成像实验中，与上述实验相似，Alexa-594染料（Thermo Scientific，100 µM）作为结构标记。对于使用APV，TTX，NifeDipine，Xespospongin C和MK-801的实验，将切片与BTSP实验之前的药物一起孵育超过30分钟，并在整个记录过程中应用。对照实验是在添加药物之前每天进行的。对于DMSO控制实验，每天准备不同的ACSF溶液。在Thapsigargin和U73122的实验中， 在实验之前，将切片与药物至少60分钟孵育。对于QX314实验，我们在建立全细胞贴片夹后3-5分钟开始记录，并且仅考虑了BTSP方案在当前注入期间没有引起任何尖峰的细胞进行进一步分析。除非另有说明，否则所有药物均从Tocris Biosciences购买。EPSP是在诱导BTSP之前和之后测量的。在所有整个细胞记录中，在整个记录中都监测了串联电阻在10到40MΩ之间。

　　HeLa细胞（美国型培养物收容，CCL-2）和HEK293FT细胞（Thermo Fisher）在Dulbecco的改良鹰培养基中生长，在5％CO2中，在37°C下补充了10％FBS。使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）将质粒转染到HeLa细胞中。转染后24–48 h在HEPES缓冲ACSF溶液（20 mM HEPES pH 7.3、130 mm NaCl，2 mm NaHco3、25 mm -glucose，2.5 mm -kcl和1.25 mm NAH2PO4）中，用2 mm cacl2和2 mm cacl2和2 mmmmmgcl 2pflim and 2pplim and 2pplim and 2pplim，当指示时，用沐浴的离子霉素（Tocris Biosciences）和EGTA刺激细胞。

　　使用自由泳293（Thermo Fisher）在自由泳293（Thermo Fisher）中培养的表达载体DNA（2 µg）被转染到HEK293S GNTI-GNTI-GNTI-细胞（6孔板中的2×106细胞）中。转染后48小时收集细胞，用冰冷的PBS洗涤，并使用Misonix Sonicator 3000（3次，30 S，功率水平为9.0）在250 µL TBS（20 mM Tris-HCl（pH 8.0）和200 mM NaCl）中进行超声处理。裂解液以70,000 r.p.m.持续10分钟（TLA110转子）。将上清液（20 µL）加载到超级6尺寸排斥色谱柱（10/300 GL; GE Healthcare）上，并用TBS进行预校准，并以0.4 mL min-1 – 1的流速运行。使用以下设置的荧光计（RF-10axl，Shimadzu）检测到Superose-6柱的洗脱液：激发，475 nm；排放，507 nm；时间增加，0.5 s;集成时间，1 s；和记录时间，75分钟。使用OriginPro Graphic软件（OriginLab v.9.5）绘制了荧光耦合尺寸排斥色谱数据点。

　　使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher）用质粒转染HEK293FT细胞（Thermo Fisher），并在37°C和5％CO2培养2天。在PBS缓冲液中洗涤板孔一次后，将细胞用M-Per哺乳动物蛋白提取试剂（Thermo Scientific）（包括停止蛋白酶抑制剂（Thermo Scientific）和5 mM EDTA裂解5分钟。将裂解物以20,000g离心10分钟，并通过在PBS缓冲液中稀释2-15倍（包括蛋白酶抑制剂），用于荧光相关光谱（FCS）测量。FCS测量在23°C下在两光子显微镜下进行，而无需激光扫描，配备了Ti：蓝宝石激光器（Chameleon Ultra II，相干），可调节到920 nm的波长。使用水浸泡物镜（Lumplanfl N×60 Na 1.0 W，Olympus）收集了60-120 s的时间相关的单光子计数数据，该数据直接浸入了300 µL裂解液溶液中，即单光子计数板（Time Harp 260，Picoquant，picoquant）和TTTTTR的Softect of Time corraratr corraratr corrarator 3.使用Focus Point Software37进行数据分析。

　　使用先前描述的PAAIP2（参考文献12），在器官海马切片中进行了CAMKII抑制实验。在这些实验中，切片每片用0.5-1 µl AAV混合物（以2×1012 Vg含有AAV9-CAMK2A-CRE（每毫升1：1,000稀释），Addgene（1055558-AAV9）和RAAV8-DIO-CBA-PAAAIP2-MEGFP，ADDGENE（1055558-AAV9）和4.2-megfp at 4.2-MEGFP，体外4-6在体外成像或斑块10–13。

　　如前所述38，使用定制的两光子荧光寿命成像显微镜进行2PFLIM。使用Ti：Sapphire激光器（相干，变色龙或Spark Alcor 920 nm（Spark Lasers））以920 nm的波长为1.0-1.4 mW进行2PFLIM成像。使用水浸泡物镜（×60，Na 0.9，Olympus）收集荧光发射，并用二角镜（565 nm）分开，并用两个分离的光电部乘数管检测到波长过滤器后放置的光电派乘管（Chroma，510/70-2p for Green和620/90/90-2p for Red）。使用低传递时间扩散（H7422P40; hamamatsu）的光电子乘数管检测到红色和绿色荧光。使用定制软件（https://github.com/ryoheiyasuda/flimage_public），使用时间相关的单光子计数板（Time-Harp 260，Pico-Quant）进行荧光寿命成像的光子计数。以7.8 Hz（每帧128毫秒）的帧速率以64×64像素收集2PFLIM图像，并用30帧的移动平均线进行过滤时过程。第二个Ti：以720 nm波长调谐的蓝宝石激光器被用来脱离MNI型谷氨酸。

　　Ca2+成像是通过将钙染料Cal-590（50–100μM，AAT BioQuest）与结构标记物Alexa-488（100μM，Thermo Fisher Scientific）一起进行。Ca2+传感器强度测量以64×64像素以7.8 Hz的形式收集，使用2PFLIM（未使用寿命信息）。通过用Alexa-488的强度标准化强度来计算Ca2+响应。在电流夹模式下，在CA2+成像期间还记录了膜电压。在实验的一部分中，在BTSP诱导前后测量了未纳入诱发的EPSP。对于同时的Ca2+和CaMKII成像实验，将Ca2+归一化为BTSP诱导之前的前100帧的平均值。对于急性海马切片中的Ca2+成像实验，我们用电极（4-6MΩ）进行了一个全细胞贴片夹，并加载了带有基于CS+的内部溶液（见上文）加上Cal-590（50 µm）。我们测量了基线Ca2+ 2-4分钟，然后应用了已发表的BTSP方案1，从而在20 Hz时用双极电极刺激Schaffer侧支，并与突触后电流注射（300 pa 300 ms）配对，延迟750 ms，延迟750毫秒。然后，将Ca2+成像恢复了2-4分钟。使用自定义Python代码检测到CA2+事件，从而将基线噪声的标准偏差3倍用作通过线性回归获得的基础趋势线减法后的检测阈值。

　　如先前所述39进行了2PFLIM分析。为了测量与受体（结合分数）经历FRET的供体的分数，我们拟合荧光寿命曲线，将所有像素求和整个图像上的所有像素均具有双重指数函数，该函数与高斯脉冲响应函数相连，如下所示：

　　其中τAD是与受体结合的供体的荧光寿命，PD和PAD是分别与受体的FRET的自由供体和供体的比例，而H（t）是荧光寿命曲线，具有与高斯脉冲响应函数相连的单个指数函数：

　　其中τd是自由供体的荧光寿命，τg是高斯脉冲响应函数的宽度，F0是卷积之前的峰值荧光，T0是时间偏移，而ERFC是互补误差函数。

　　为了生成荧光寿命图像，我们计算了平均光子到达时间， ，在每个像素中如下：

　　然后，平均光子到达时间与平均荧光寿命有关， <τ>，通过偏移到达时间T0，通过拟合整个图像如下：

　　为了分析利益区域（ROI）（棘突或树突）中的荧光寿命，我们通过将衰减曲线与方程式（1）拟合，假设τd，τad，τg和t0是每个图像会议中的常数，则计算了荧光寿命。为了测量BTSP和对照实验的CAMKII发生时间和峰值寿命变化，首先使用前100个帧作为基线将原始痕迹归一化，然后使用60个数据点的移动平均值来平滑归一化数据。在此处理之后，在单个CAMKII痕迹上手动计算了CAMKII峰和振幅的时间。

　　所有值均表示为平均值±S.E.M.除非另有说明。独立测量或细胞（n）的数量在图或图传说中指示。对于电生理实验，记录是从至少2个不同的垃圾中对9-26个神经元（每片1个神经元）进行的。为了进行成像实验，从至少2个不同垃圾的至少5个神经元（每片1个神经元）的12-82个树突上独立地进行了实验。对于药理学实验，在将特定药物添加到ACSF之前，在同一切片上进行了1-2个对照实验。在将DMSO用作车辆的实验中，我们在不同的日期进行了对照实验，但在与实验中使用的相同批次制成的切片上进行了对照实验。未配对的两尾学生的t检验用于比较两个独立的样本。配对的两尾学生的t检验用于比较因变量（在soma – dendrite之后）。单向方差分析和邓内特的多重比较测试用于比较两个以上的独立样本。双向方差分析，然后是Dunnett或Tukey的多重比较测试来比较分组的数据集。相关分析是通过计算Pearson相关系数来完成的。数据是在Microsoft Excel中组织的（V.2016）。数据平滑，统计测试和P值在每个图中都记录在图例中，并使用GraphPad Prism计算（V.7.03，9.5）。无花果的示意图。使用Microsoft PowerPoint（V.2016）和Adobe Illustrator（V.27.9.1）创建了1A，3A和5A以及扩展数据图13。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。