人多晶型缓冲液含有20 mM HEPES pH 7.5、140 mM KCl，10 mM NH4CL，2 mM的精子和5毫米之前。进一步补充了人类多晶液缓冲液，并用5 mM MGCL2和还原剂（Cryo-EM 1 mM DTT，SMFRET的1.5 mM 2-甲醇）。电荷缓冲液包含50 mM Tris pH 8.0、10 mM KCl，100 mM NH4CL，10 mM MGCL2、1 mM DTT，5 mm ATP和0.5 mm EDTA。AM/FM缓冲液含有50 mM Tris pH 7.5、7 mM MGCL2、150 mm KCl，5 mm ATP，0.5 mm DTT和1 mm EDTA。杂交缓冲液含有10 mM HEPES pH 7.0、150 mM KCl和0.5 mM EDTA。上面的缓冲液作为5×储备制备，在液氮中存储在-80°C下，并在使用前融化。

　　核糖体裂解缓冲液含有20 mM Tris pH 7.5、100 mM KCl，5 mM MGCL2、1 mM DTT，5 mM perrescine，350 µM CHX，4 U ML-1 RNase，1×Halt prot酶抑制剂，0.5％NP-40和20 U的Turbo DNase。亚基拆卸缓冲液包含20 mM Tris pH 7.5、300 mM KCl，2 mM MGCL2、1 mM DTT和2 mM紫霉素。EIF5A缓冲液含有50 mM磷酸盐缓冲液pH 8.0和300 mM NaCl。S缓冲液包含50 mM Tris pH 7.0、0.1 mM EDTA和1 mM DTT。EIF5A存储缓冲液包含25 mM HEPES pH 7.5、100 mm KCl和1 mm DTT。ACP标记缓冲液包含50 mM HEPES pH 7.5和10 mM MGCL2。

　　SR-A3和PLT在房屋中合成；HHT来自Santa-Cruz Biotechnology；ANS，CHX和LTM来自EMD Millipore。所有六种药物均溶于DMSO。GTP和GTPγs来自Sigma-Aldrich，并使用Mono Q 5/50 GL柱（Cytiva）进一步纯化。CY3-甲酰亚胺是内部合成的，LD555合成，LD655-NHS来自Lumidyne Technologies。DNA寡素和Gblocks来自IDT，合成RNA（mRNA）来自Horizo​​n Discovery（补充表2）。限制酶（BAMHI-HF和BPSDI），切割玛特缓冲液和吉布森组装主组合来自NEB。DMEM，青霉素，链霉素，胰蛋白酶-EDTA和PBS来自Lifetech，FBS来自亚特兰大生物学。Lipofectamine 2000，RNase Out，Turbo DNase和DH10B细胞来自Invitrogen。Quickextract来自Lucigen。Expi293表达培养基来自Gibco。兔网状细胞裂解物来自绿公顷。停止的蛋白酶抑制剂和HEK Expi293F细胞购自Thermo Fisher Scientific。BL21（DE3）plys细胞来自Sigma-Aldrich。所有其他化学物质均来自Sigma-Aldrich或VWR。

　　我们使用基于CRISPR-CAS9的基因组工程来生成表达UL11 N末端融合到A1肽TAG52的细胞系。HEK293T细胞在DMEM中的六孔板中生长至约70％的汇合，为10％FBS和100 µg ML-1青霉素和链霉素。然后将细胞用质粒PX45953（Addgene，62988）转染，该细胞包含靶向RPL12（编码UL11）的SGRNA序列的开放阅读框架（ORF）（ORF）（ORF）的起始密码子附近的sgrNA序列（编码UL11），以及使用LIPOFOFFURICTION，用于使用Lipoffection的dsdna Template54，用于使用LIPOFOFINE的DECTERTION，使用Lipoffection transection。选择（1.5 µg mL -1）持续48小时，每24小时交换培养基。选择后，将细胞以每盘1,000个细胞的密度转移到10 cm培养皿中，并左生长直至形成可见菌落。使用移液器将这些菌落转移到96孔板上，并长到约70％。然后将每个96孔的细胞板分成两个96孔板。生长至约70％的汇合度左右后，通过将细胞在Quickextract和PCR中放大RPL12基因座的细胞来成功插入A1标签。PCR扩增子用限制酶处理，该酶切割了修饰但未修饰的等位基因。裂解后，将样品加载到琼脂糖凝胶上，并分析带模式以鉴定未修饰的，杂合的修饰和纯合细胞系。将纯合细胞系传播，并用于纯化核糖体亚基。

　　核糖体亚基是根据改编自先前研究的方案制备的。19。对于野生型亚基，HEK Expi293F细胞在Expi293表达培养基中生长。当细胞密度达到每毫升6×106细胞时，加入350 µM CHX。然后，5分钟后，通过离心收集细胞。对于A1-UL11亚基，将HEK293T细胞在T225烧瓶中生长在DMEM的T225烧瓶中，其中10％FBS和100 µg Ml-1青霉素和链霉素和链霉素链霉素与约70％的融合，并用含有350 µM CHX的PBS洗涤，并从含有0.25％Trypsin-trypersin-trypsin-exem的CHX提升，含有0.25％Trypsin-Edta chx，含有350％的CHX，含有dm trypersin-drypersin-drypersin-drypersin-endecin-exem-chx con350 µm CHX，并通过离心颗粒。对于这两种细胞，将所得的颗粒重悬于含350 µM CHX的PBS缓冲液中，并再次固定。含有约3亿个细胞的颗粒在液氮中闪烁，并储存在-80°C下。

　　为了裂解细胞，将含有1.8×109个细胞的颗粒放入50 ml不锈钢冷冻剂燃料容器（RETSCH）中，并使用MM400冷冻剂（RETSCH）在25 Hz时进行5次3分钟，将容器置于每个铣削周期之间5分钟的液体氮气浴中。将所得的细胞粉重悬于冰冷的核糖体裂解缓冲液中。使用Allegra X30R离心机（Beckman Coulter）将裂解液以4,000 rpm离心15分钟。然后使用5424-R离心机（Eppendorf）在4°C下以15,000 rpm的速度再次离心上清液15分钟。将第二个离心的上清液加载到六个蔗糖梯度（10–50％蔗糖，20 mm Tris pH 7.5，100 mm KCl，5 mm MGCl2，1 mm DTT，5 mm dtt，5 mm putrescine和350 µm CHX）中，使用梯度主IP 107（BiocoComp）制备。使用SW32转子（Beckman Coulter）在4°C下以30,000 rpm离心3小时，并使用BR-188梯度分析仪（Brandel）分离含有多聚溶酶体的馏分。使用Ti45转子（Beckman Coulter）以45,000 rpm离心在45,000 rpm的45,000 rpm下进行颗合体（贝克曼·库尔特）。

　　为了将大和小的核糖体亚基（分别为LSU和SSU）分离，将含多聚糖的颗粒重悬于亚基拆分缓冲液中，最终体积为2 mL，并在37°C下在温和的搅拌下孵育30分钟。使用5424-R离心机（Eppendorf）在4°C下以15,000 rpm离心15分钟，以除去不溶性的材料，并将所得的上清液加载到六个蔗糖梯度上（10-40％蔗糖20 mm Tris pH 7.5，300 mm kcl，2 mm kcl，2 mm kcl，2 mm mm gcl，2 mm mmgcl2和1 mm gcl2和1 mm gcl2和1 dtt）系统。使用SW41转子（Beckman Coulter）在4°C下以40,000 rpm的速度在40,000 rpm处离心7小时，并使用BR-188梯度分析仪（Brandel）分离含SSU-和LSU的峰。使用TLA100.3转子（Beckman Coulter）以80,000 rpm离心在4°C下以80,000 rpm离心12小时，将核糖体亚基固定。将核糖体亚基（通常约为400 pmol）重悬于含5 mM MGCL2和1 mM DTT的人多晶纤维缓冲液中，在液氮中闪光液，并存储在-160°C下，以供未来使用。

　　基本上如前所述55,56，制备了大肠杆菌trnafmet和trnaphe并分别用CY3和LD655标记。大肠杆菌TRNA的用于先前讨论的原因19。用于过表达trnafmet的pbluescript质粒最初是U. L. Rajbhandary57实验室的礼物。用于过表达Trnaphe的pbluescript质粒最初是K. Nierhaus58实验室的礼物。

　　如先前所述19,40所述，使用从先前的研究59修改的方案中从兔网状细胞裂解物中分离出伸长因子EEF1A。

　　完全无偶然的EIF5A1是使用大肠杆菌中的过表达来制备了先前研究的质粒PST39。通过添加A2肽TAG52，TEV裂解位点和6倍他的标签以进行纯化，可以扩展EIF5A1的N末端。通过首先使用BAMHI-HF和BPSDI消化质粒，在切割的Cutsmart缓冲液中插入60分钟，从而插入这些修饰，从而插入这些修饰。然后将含有140 ng消化质粒的消化反应（7.2 µL）与10 µL的Gibson组装主混合混合和0.4 pmol（6 µl）混合，其中含有修饰的EIF5A1序列。在50°C下进行30分钟的吉布森反应，然后使用2 µL混合物转化25 µL的DH10B化学竞争细胞。

　　为了过表达EIF5A1，将修饰的PST39质粒转化为BL21（DE3）plys细胞，它们在37°C的LB培养基中生长，其中含有100 µg ml -1氨基霉素和25 µg ml -1甲基二甲基二氯基苯甲酸在600 nm的温度下，并将其调整为0。IPTG。诱导后18小时收集细胞，在液氮中闪烁，并储存在-80°C下。将细胞（20 g）重悬于含有10 mM咪唑和1×停止蛋白酶抑制剂的EIF5A缓冲液中，并使用SonIFIER 450（BRANSON）进行超声处理，为45 s的10个周期（占空比6，强度60％），每个周期之间的ICE上有2分钟。使用JA25转子（Beckman Coulter）在4°C下以25,000 rpm离心30分钟来清除所得的裂解物，并将上清液直接应用于台式NI-NTA柱（Qiagen）。通过裂解液，将柱树脂重悬于10 mL含有20 mM咪唑的EIF5A缓冲液中。将结合的EIF5A1在含有250 mM咪唑的8 mL EIF5A缓冲液中洗脱。将所得洗脱液透析（> 250倍）与S缓冲液相对于S缓冲液。透析后，使用Allegra X30R离心机（Beckman Coulter）在4,000 rpm以4,000 rpm离心10分钟，将洗脱体稀释至16 mL，并将其加载到HITRAP SP HP HP柱（Cytiva）上。然后使用S缓冲液中的0-500 mM KCl梯度洗脱EIF5A1，分别收集代表未悬浮的EIF5A1（参考文献60）的峰，并分别收集透析（> 1,000×稀释）过夜，过夜，对EIF5A存储缓冲液。EIF5A1在液氮中闪烁，并在-160°C下储存，以供将来使用。

　　为了准备含有p-Site结合的met-tRNAfmet并在一个站点中显示密码子或UCU的核糖体IC，首先将mRNA在其5'结尾中以生物素化的dsDNA“ Pogo Stick”的形式退火，该末端是通过将100 pmol的100 pmol的mRNA与100 pmol的dsdna pogo固定在377°C中的100 pmol coge clufferbride c. 377°°c coge coge。然后，将20 pmol的SSU，热激活（42°C 5分钟）与80 pmol的MRNA Pogo-stick复合物混合在人类多聚合物缓冲液中，总体积为25 µL，并在37°C下孵育10分钟。同时，通过在含有5 mM甲硫氨酸的AM/FM缓冲液中孵育，在37°C的总体积为10 µL的情况下，将30 pmol大肠杆菌tRNAFMET与蛋氨酸充电15分钟。然后将电荷反应与结合mRNA的SSU混合，并在37°C下孵育10分钟。随后将所得的混合物与20 pmol的热激活LSU在37°C的总体积为50 µL下孵育20分钟。当使用荧光标记的LSU时，首先通过与COA激活的LD555和ACPS61在ACP标记缓冲液中在37°C中孵育120分钟。孵育后，将MGCL2浓度调节至15 mm，并在SW41转子（Beckman Coulter）中以35,000 rpm离心90分钟，在10-40％的蔗糖梯度中，在包含15 mm MgCl2和1 mm DTT的人类Polymix中使用10-40％的蔗糖梯度，使用了15 mm MMMM MM DTT，使用准备好的渐变，使用了渐变，使用了渐变。使用BR-188梯度分析仪（Brandel），在液氮中闪烁，将对应于组装的核糖体配合物的峰从梯度上分离出来，并将其存储在-160°C以供将来使用。

　　LD655-trnaphe通过孵育0.25 µm LD655-Trnaphe，含有0.1 µM EEF1A，0.625 mM GTP或GTPγS或GTPγS，培养为0.25 µM LD655-Trnaphe，将LD655-Trnaphe充电并结合到EEF1A三元复合物中。0.6 µm肌动酶和0.6 µm丙酮酸激酶41在37°C下持续15分钟。三元络合物被储存在冰上，并在形成后立即使用。

　　所有SMFRET成像实验均在25°C或37°C下使用定制的Prism型TIRF显微镜62进行。温度控制是通过将显微镜阶段封闭在温度控制的室中来实现的。用532 nm二极管泵送固态激光器（Opus，Laserquantum）在0.08或0.8 kW cm-2（分别为10毫米和100毫米的整合时间）下照亮表面相关的核糖体。使用×60/1.27 Na超分辨率水免疫物镜（Nikon）收集供体和受体荧光团的荧光发射，通过ET550LP滤波器（Chroma）通过ET550LP滤波器（Chroma）进行散射激发光，以在Multicam设备（CAIRN）（CAIRN）中频繁地分裂，并通过640LPXR DICHOMA（CHRMAN）（通过640LPXR plase/chroma）（通过645ET685/50，Chroma），最终投影到两个带有2×2像素套件的对齐和同步的Orca-Fusion SCMOS摄像机（C14440-20UP，Hamamatsu）上。使用Labview（国家仪器）编写的自定义软件进行仪器控制。从录制的视频中提取供体和受体荧光强度，使用Spartan软件包62计算了伽马和串扰的校正和FRET效率痕迹。根据以下标准选择FRET痕迹进行进一步分析：一个灾难性的光漂白事件，至少8：1信号/背景噪声比和6：1信号/信号噪声比，少于四个供体 - 荧光团闪烁事件，以及捐助者和受体之间的相关系数和<0.5的受体。使用HMM理想化方法，使用Spartan软件包中实现的Semental K-均值和MIL算法进一步分析了所得的SMFRET痕迹。

　　使用Spartan软件包62和MATLAB R2019A中实施的标准非线性拟合和排序方法进一步分析了所有SMFRET数据。在斯巴达人中产生了种群直方图和过渡密度图。通过使用Spartan中实现的HMM方法将迹线的痕迹的后同步进行了对特定事件的同步，然后在感兴趣的状态下识别首次到达。然后将跟踪对应于与此事件相对应的视频框架或到达第一个非零FRET效率状态，并截断，使事件发生前的5帧和事件后的45帧。然后生成同时同时化的种群直方图和过渡密度图，以评估感兴趣事件周围的动态。

　　通过确定越过背景噪声阈值的所有事件，消除了第一个和最后的事件，以最大程度地减少混合时间和光漂白动力学的影响，然后在此类事件之间估算零-FRET效率状态中的停留时间。然后使用这些停留时间来构建零状态停留时间的累积分布。单个指数函数适合此分布，以估计平均零状态停留时间，然后将其用于计算关联速率常数。

　　通过确定每条迹线的首次访问对可容纳的FRET效率状态的访问，可以估算稳定tRNA的催化效率。然后，使用从跟踪开始到此事件的等待时间来构建到达时间的累积分布。具有延迟以说明混合时间的两指数函数适合此分布以估计平均到达时间，然后将其用于计算催化效率。

　　通过首先识别每个迹线的首次访问对可容纳的FRET效率状态，然后第一个通过此容量事件之前的背景噪声阈值首先识别对可容纳的FRET效率状态的首次访问来估计所有解码步骤的合并率。然后，将这两个事件之间的时间用于在通道时间构建累积分布。然后将两个指数函数拟合到此分布中，以估计平均通过时间。

　　EIF5A与经典核糖体结合的平衡解离常数是通过在不同的EIF5A浓度下拟合高斯函数与平衡FRET效率分布来确定的，以估计经典状态核糖体的分数。然后将这些馏分与EIF5A浓度绘制，并以下方程描述配体与两个可能的结合伴侣构象之一的平衡结合适合Data63：

　　Where fc is the fraction of classical state ribosomes, AC5A is the fraction of time the ribosome spends in classical-state-like FRET efficiency states when bound to eIF5A, ACapo is the fraction of time the ribosome spends in classical-state-like FRET efficiency states when free from eIF5A and KD is the dissociation constant for eIF5A binding to classical-state ribosomes.

　　为了制备人核糖体IC，将200 pmol的热激活（42°C持续5分钟）与400 pmol的mRNA混合在含有0或20 µM LTM的人多晶纤维缓冲液中，总体积为45 µL，并在37°C下孵育10分钟。同时，通过在含有5 mM甲基氨酸的AM/FM缓冲液中孵育，在37°C的总体积为12 µL的AM/FM缓冲液中孵育350 pmol E. coli tRNAfmet，在37°C的AM/FM缓冲液中孵育15分钟。使用TSK苯基-5PW柱（TOSOH Bioscience）验证完整的tRNA充电。然后将含有300 pmol的Met-tRNAfmet的电荷反应与含mRNA的SSU混合，并在37°C下孵育10分钟。随后将所得混合物与200 pmol的200 pmol热激活LSU在37°C下在总体积为80 µL的情况下孵育20分钟。孵育后，将MGCL2浓度调节至15毫米，并通过在SW41转子（Beckman Coulter）中以35,000 rpm的35,000 rpm离心150分钟将核糖体配合物在人类多聚合物中的10–40％蔗糖梯度中纯化，其中包含15 mm MGCl2，1 mm MM DTT和20 mm dttt and int MMM DTT和20 µM。（Biocomp）。使用BR-188梯度分析仪（Brandel）从梯度上隔离梯度，在TLA 100.3转子（Beckman Coulter）中以80,000 rpm离心3 h，将3 h，并置于人体polymix 5.6 µm的最终浓度为3.6 µM MMM-M-M-M-M-grymm-grymm-grymm，从80,000 rpm隔离梯度，从梯度隔离了梯度。液氮并储存在-160°C以供将来使用。

　　大肠杆菌trnaphe通过孵育含有10 µM trnaphe，2.5 mM苯丙氨酸，3.75 mM PEP，PEP，6 µM PERES，0.6 µM肌动酶和0.6 µM倍维酸盐激酶在37°°C的电荷缓冲液中的15分钟中的电荷反应均为苯丙氨酸。使用TSK苯基-5PW柱（Tosoh Bioscience）验证了tRNA的完全充电。然后，通过温育0.55 µm EEF1A，1 mMGTPγS，40 µM EIF5A1和足够的电荷反应来制备三元复合物，以使最终的Phe-Trnaphe浓度在含有5 mM MM MM MM MM MM MM MM MM MM SR-SR-SR-SR-SR-A3，50 µm CHX的人类多聚合物缓冲液中达到0.5 µm在37°C下，50 µm ANS和500 µm LTM 10分钟。孵育后，将三元复合物混合物放在冰上，并立即用于冷冻EM栅格制备。

　　与EIF5A以及HHT和CHX或LTM混合人核糖体IC，并在室温下将60 s孵育，然后与三元复合物混合物一起孵育，产生最终伸长型复合物混合物，其中含有0.95 µM，含有0.25 µm三元型复合物，30 µm EIF5A和30 µM EIF5A和10 µM PLT，或500 µm PLT和500 µm和500 µm和500 µm和500 µm ANS，或者10 µm SR-A3、50 µM HHT和500 µM CHX。

　　使用Vitrobot Mark IV陷入困境（Thermo Fisher Scientific）制备网格。对于每个实验，在三元复合物添加后，立即将3 µl伸长复合物混合物应用于QF R1.2/1.3 AU 300 Mesh Cryo-Em Grid（Quantifoil）在10°C和95％的湿度和95％的湿度，使用Solarus ii plasma plasma Cleaning System（gatan）在AR/O2中发光20 s。添加伸长复合物混合物后，将网格立即印迹（印迹力-5）14 s（PLT，ANS和LTM）或6 s（SR-A3，HHT和CHX），并将其刺入液体乙烷中。

　　使用Titan Krios G3i（Thermo Fisher Scientific）透射电子显微镜收集冷冻EM数据，该透射率具有300 kV的加速电压，该电压配备了Gatan K3 Direct Electron探测器，该探测器在超级分辨率模式下运行，并采用后柱后BIO量子量子GIF（能量过滤器）。K3增益参考是在数据收集之前获得的。使用Serialem Software64使用图像移位方案（每9个孔的一个散焦测量）进行数据收集，该散热器值从-0.5 µm到-1.5 µm。

　　对于与PLT，ANS，LTM和GTPγS结合的核糖体配合物，记录视频的放大倍数为×105,000，对应于样品水平下的像素大小为每个像素的0.826Å（超分辨率像素尺寸为0.413Å每个Pixel）。合并了两个会话期间收集的三个网格的数据。收集来自Grid 1的视频，使用70帧（每帧40毫秒）和每帧0.9401 E-剂量为0.9401 E-，总剂量约为每36 e -2。收集来自网格2的视频，每帧60帧（每帧50毫秒）和每帧1.318 E-剂量为1.318 E-，总剂量为79.101 E-每Å2。收集来自网格3的视频，每帧60帧（每帧50毫秒）和每帧1.177 E-剂量为1.177 E-，总剂量为70.593 E-每Å2。

　　对于与SR-A3，HHT，CHX和GTPγS结合的核糖体配合物，以倍数×130,000的放大率记录了视频，该视频在样品水平下的像素大小为每像素的像素大小为0.6854Å（超分辨率的像素大小为0.3247ÅEver / pixel）。在1.6 s暴露期间，收集80帧（每帧20毫秒和每帧1 e-剂量），总剂量约为每Å20e-2。数据收集参数的其他信息在扩展数据表1中提供。

　　在原始的超分辨率视频堆栈上进行了运动校正，并使用MotionCor2 Software 65分别进行两个数据收集。使用CTFFIND466确定CTF参数。使用CISTEM67挑选颗粒，并分别将坐标转移到Relion（v.3.1）68中，以进行两个数据收集。将两个数据集合的颗粒汇总，在Relion（v.3.1）中提取，并将粒子堆栈转移到CryoSparc69中。使用四倍的binned颗粒（像素尺寸=3.304Å）进行了几轮2D分类，以消除冰，碳边缘和假阳性颗粒。然后将颗粒进口，并在Relion中进行3D自动构造（v.3.1）。所有进一步的分类均在Relion（v.3.1）中进行。

　　单独运行三个无带对齐的全局3D分类，改变了类（k）的数量（k）和正则化参数（t）。合并了来自独立分类的EEF1A的类，并去除重复的粒子。同样，还合并了包含具有EEF1A的经典核糖体颗粒的类。一个3D分类还产生了一个包含p点tRNA和EIF5A的类，该类构成了与EIF5A结合的最终可容纳重建。

　　含有经典核糖体的一组颗粒，没有强有力的EEF1A证据。为了识别尽可能多的EEF1A结合的颗粒，我们进行了四个独立的3D分类，而没有比对改变K和T参数，该参数围绕（1）EEF1A或（2）“配体”：EEF1A，AA-aa-tRNA和PITE tRNA。两种使用EEF1A掩码的分类都以两个构型（状态I和II）鉴定出EEF1A结合的粒子。使用配体掩模的两种分类都鉴定出含有状态I EEF1A的粒子。我的状态我非常类似于在第一轮全球分类中确定的EEF1A结合类。将所有包含EEF1A的颗粒在状态I中汇总，去除重复的颗粒，剩余的颗粒被3D自动精制并进一步分类以产生GA重建。同样，将所有在状态II中包含EEF1A的颗粒汇总，去除重复的颗粒，剩余的颗粒被3D自动精制并进一步分类以产生CR重建。使用配体蒙版的分类之一也鉴定了一个没有EEF1A的类，但包含P位点tRNA。该类是3D自动精制的，并进一步分类以产生IC重建。

　　在州II中包含EEF1A的颗粒的3D自动refine图对EEF1A和AA-TRNA（三元络合物）的冷冻EM密度相对较弱，因此我们使用围绕Ternary复合物周围的软膜进行了两个连续的专注3D分类，可为Ternary综合体选择最高的Cryo-Em密度。该类构成了CR重建。

　　接下来，我们的目的是使用焦点的3D分类，其中包含含有经典的E-Site tRNA和L1茎的柔软掩码，并在状态I中识别类似于EEF1A的EF5A的粒子，并且具有EEF1A。对于State II中包含EEF1A的颗粒，避免对电子点含量进行进一步的分类以保留粒子数。对于这两组粒子，我们进行了三个连续的聚焦电子站点分类，以消除具有E位置tRNA的颗粒，并在3D自动再填充之前选择含有EIF5A的颗粒。对于没有EEF1A的集合，所得类构成与EIF5A结合的IC重建。对于在状态I和EIF5A中包含EEF1A的集合，我们观察到了SSU接触EEF1A的异质密度，因此我们使用包含SSU肩部结构域的软面膜进行了重点的3D分类，选择了具有EEF1A强密度的类。该类构成与EIF5A结合的GA重建。在扩展数据图2和扩展数据表1中提供了有关冷冻EM分类管道和参数的其他信息。

　　为了帮助对EEF1A和PLT进行建模，将131,115个颗粒从状态I中鉴定为eef1a，是从未扣除的，抛光的颗粒中提取的，用于信号减法和3D分类而无需对齐。该分类产生了71,219个有序的颗粒，然后将其用于3D自动填充和后处理。

　　平行于复合物的3D分类，在最初的3D分类步骤后核糖体颗粒被汇总，如图2（厚度虚线灰线）中所示，并重新提取而无需固定以获得与LSU的聚焦结构的共识结构。获得共识结构所涉及的所有步骤均在Beta 2版本的Relion（v.4.0）70中执行。这种共识结构用作CTF完善的输入，以完善束倾斜，三叶和四翼畸变，各向异性放大倍率，每颗粒液和每片尺度散射68。光学组（n = 27）是根据数据收集过程中每个网格的图像移位模板定义的。在将数据与贝叶斯抛光的不同网格/数据收集会话中分开之前，先进行了另一种以LSU为重点的精炼71。抛光后，对另一种以LSU为中心的细化进行了数据，并再次进行CTF细化，以进一步完善各向异性放大倍率的参数，然后进行梁倾斜估计和高阶差异，最后是每粒子defocus defocus and Perimcrographs Astigmatism。从这些“闪亮”粒子中选择了在分类过程中确定的兴趣类别，以进行最终的3D自动限制。

　　共识结构还进一步处理，以进行更高的分辨率和建模目的。第二轮CTF细化后，在合并的颗粒上进行了另一种以LSU为中心的细化。还进行了80年代的改进，并在以局部角度搜索的方式进行以SSU为中心的精炼。最后，使用最终细化的元数据用于创建带有relion_reconstruct的ewald-sphere校正的半映射，用于后处理至1.67Å，为1.67Å，SSU为1.84Å。锐化和局部过滤的地图用于人物制备并有助于建造模型。在扩展数据图2中提供了更多信息。2和3和扩展数据表1。

　　在原始的超分辨率视频堆栈上进行运动校正，并使用MotionCor2（参考文献65）分别对两个数据收集进行了bined bined。使用CTFFIND4（参考文献66）确定CTF参数，并在后面（v.3.1）68和Relion（v.4.0）70中进行完善。在采摘粒子之前，良好的显微照片是通过功率谱进行资格的。使用CISTEM67挑选颗粒，并分别将坐标转移到Relion（v.3.1）中，以进行两个数据收集。将两个数据集的颗粒汇总，在依赖（v.3.1）中提取，并将粒子堆栈转移到冷冻par。进行了几轮2D分类（四倍和八倍的binned），以消除冰，碳边缘和假阳性颗粒。粒子在Relion（v.3.1）中进行3D自动精制（四倍），然后进行两轮3D分类 - 首先是对齐（Angular采样间隔为1.8°，四倍折叠），然后没有对准（Twofofold binned）。选择具有EEF1A密度的类以进行持续改进（LSU共识）或分类（GA）。

　　对于LSU共识络合物，将颗粒提取并以每个像素为0.685Å，然后进行3D精炼，并配有LSU面膜，CTF细化，贝叶斯抛光，3D抛光，3D改进，并配有LSU蒙版，CTF精炼，CTF精炼和最终的3D改进，并在LSU中使用LSU boke in Resion（V.4.0）。

　　对于GA复合物，Relion（v.3.1）中的另一轮3D分类产生了EEF1A密度强的类。这些颗粒是从LSU共识复合物加工中产生的未扣除的，抛光的颗粒中重新提取的，并在Relion中自动预制（v.4.0）。还对这些粒子进行了信号减法的EEF1A的焦点，以帮助对EEF1A和SR-A3进行建模。锐化和局部过滤的地图用于人物制备并有助于建造模型。在扩展数据图2和扩展数据表1中提供了更多信息。

　　使用USCF Chimera72，手动将人类核糖体原子模型（蛋白质数据库：6QZP）手动安装到高分辨率（1.67Å）共识冷冻EM重建中。使用启动模型用于构建tRNAFMET（PDB：3CW6），TRNAPHE（PDB：4WRO），EEF1A（PDB：5LZ：5LZ）和EIF5A（PDB：PDB：3CPF）的冷冻EM图。mRNA是从头建造的。通过使用phenix.Real_Space_refine73，通过组刚体的细化，全局最小化和模拟退火的模拟退火来实现地图和模型之间的更好一致性。随后，核糖体蛋白和RRNA是使用CCP4程序套件中的ARP/Warp Classic EM模块自动构建和完善的74。对模型几何形状进行了进一步的微调，并根据先前使用CCP-EM76的metage75评估了精制模型之间的一致性和冷冻EM图之间的一致性。该模型与3D体积一起检查，并通过COOT77中的迭代模型构建进一步改进。由于具有高分辨率的核糖体在高分辨率下解析，因此可以根据实验性冷冻EM图明确分配翻译后和转录后修饰78,79。此外，根据协调数和几何形式分配了MG2+和K+离子。80。建立了小分子，改性核苷酸和氨基酸的3D模型，并使用Jligand81生成了用于模型细化的几何约束。该共识原子模型被用作从同一数据集获得的解码中间体的重建的初始模型，然后重复上述协议，以进行模型构建和每个单个重建的改进。图2和扩展数据表1中提供了有关构建过程和统计数据的其他信息。

　　如前所述82（扩展数据图9a）分配了subunit桥。对于图4和扩展数据图9，当居住在彼此4Å之内时，桥接接触被认为是形成的。组成一个桥间桥的一组接触点中的每个桥接接触点都对该桥的形成也同样贡献。总桥梁形成（扩展数据图9B（桥梁接触的百分比）表示每组靠近桥桥触点形成的桥接接触点的百分比。桥梁形成的变化（图4D和扩展数据图9C（百分比变化））比较了单个接触点的差异，而不是桥梁接触的总百分比的变化。

　　使用UCSF Chimera72和UCSF Chimerax83进行了分子图形和分析。使用“ VOP量表”函数在UCSF嵌合体中的平均值= 0 = 0和σ= 1的数字准备中进行标准化。分别在UCSF Chimerax中使用MAP中的拟合和距离工具进行角度和距离测量。所有数字均使用与LSU核心的结构和模型一起制备，该结构和模型是从高分辨率的人核糖体晶体结构（PDB：6QZP）的，省略了以下移动和外围元件：LSU rRNA核苷酸：747-914，973–1279，1429，1429，1429-1429-142-1454-1454，1554，1554-154-154-154-154-154-154-154-154-154-1569，1744–1781，1956–2029，2092–2263，2476–2501，2546–2593，2649–2683，2749–2770，2895–3603，2895–3603，3753–37744753–4948和5007–5040;LSU ribosomal proteins: uL1, uL3, uL4 (amino acids 319–368), uL5, uL6, eL6, eL8, uL13 (amino acids 156–203), eL13, eL14, uL16, uL18, eL19 eL22, uL24, eL24, eL27, eL29, uL30, eL30, eL34, eL38, eL39,EL40，EL41，EL42和EL43。除非另有说明，否则在所有图像中，在所有图像中以3σ处置了冷冻密度。R.M.S.D.使用蛋白质和核酸的媒人工具在UCSF Chimerax中制备热图。使用UCSF Chimerax中的彩色区工具以3-5Å的半径为颜色。数字是在Adobe Illustrator（Adobe）中编译的。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。